Aula Prtica Testes Bioqumicos para identificao de bactrias

Aula Prática Testes Bioquímicos para identificação de bactérias São Carlos, 24 de Junho de 2020

Identificação de bactérias Coloração simples, diferenciais ou estruturais, mesmo combinadas com diferentes cultivos, não são, geralmente, suficientes para identificação de bactérias Tais métodos não revelam a fisiologia ou a filogenia das células

Testes Bioquímicos Classificação das bactérias segundo tipo de metabolismo e atividade enzimática Combinado com outras técnicas, tais como os testes bioquímicos, que permitem a identificação de bactérias, de acordo com suas propriedades metabólicas que são únicas para cada espécie.

Testes Bioquímicos Meios de Cultura Seletivo Favorece o crescimento de alguns organismos, mas suprime o crescimento de outros. Diferencial Possui um constituinte que causa uma mudança observável no meio quando ocorre uma reação bioquímica específica. Enriquecimento Contém nutrientes especiais que favorecem o crescimento de um organismo específico.

Testes Bioquímicos Ø Classificação das bactérias em relação às suas características bioquímicas: Diferentes vias metabólicas para obtenção de energia Ex: Fermentação e Respiração Enzimas específicas utilizadas no processo de metabolização de diferentes substratos Ex: Enzimas Triptofanase e Catalase • Formação de produtos específicos nas reações catabólicas Ex: Ácidos estáveis e Indol

Resultados de Testes Bioquímicos Resultados expressos como positivo (+) ou negativo (-) Identificação da bactérias de acordo com suas características já pré-estabelecidas

Atividade Prática: Execução de 5 testes bioquímicos: 1. Fermentação de carboidratos 2. Produção de indol 3. Hidrólise do amido 4. Teste de oxidação e fermentação 5. Teste da catalase

1. Fermentação de carboidratos Forma de catabolismo anaeróbio, no qual um composto orgânico é um doador de elétrons e um aceptor de elétrons Utilizado para identificação de bactérias entéricas • • • Bacilos Gram negativos; Aeróbios facultativos; Exigência nutricional simples (fermentadores de açúcares); Podem ser patogênicos ao homem, animais e plantas; Importância industrial.

1. Fermentação de carboidratos Aplicação do teste é válido pois existem características que permitem distinguir vários gêneros de bactérias entéricas Tipo e proporção de produtos de fermentação Fermentação Ácido-Mista 3 ácidos são formados em quantidades significativas: acético, láctico e succínico Fermentação Butanodiol Quantidades menores de ácidos são formadas, sendo butanodiol, etanol, os principais produtos.

1. Fermentação de carboidratos a. FERMENTAÇÃO ÁCIDO-MISTA ü Formação de diferentes tipos de ácidos e etanol; ü CO 2 e H 2 produzidos na mesma proporção; Isto porque o CO 2 é produzido somente do ácido fórmico por meio da enzima formate hydrogenase HCOOH H 2 + CO 2

1. Fermentação de carboidratos b. FERMENTAÇÃO DO BUTANODIOL Reação geral

1. Fermentação de carboidratos IMPORTANTE Razões Ácido : Neutro CO 2 : H 2

1. Fermentação de carboidratos A fermentação de carboidratos é evidenciada pela produção de ácido e/ou gás no meio de cultura em p. H neutro. Detecção Usa-se meio básico contendo apenas uma fonte de carbono e um indicador de p. H Vermelho de Metila Fermentam com produção de ácidos (fórmico, acético, láctico e succínico) e gás, até que o p. H do meio chegue a cerca de 5, 0. Exemplo: E. coli Ocorre conversão em produtos neutros como 2, 3 butanodiol, não provocando redução tão drástica de p. H. Exemplo: Enterobacter

1. Fermentação de carboidratos 2 x Leitura Incubação à 30°C por 48 h Meio Clark e Lubs Proteose peptona KH 2 PO 4 Glicose Água destilada 5 g 5 g 5 g 1 L F. Ácido mista F. de butanodiol

1. Fermentação de carboidratos Indicador vermelho de metila Leitura F. Ácido mista F. de butanodiol Cor amarela: indica p. H>5, portanto - para fermentação ácido mista. Mas se observar formação de gases é porque provavelmente ocorreu a fermentação de butanodiol. Cor rosa/avermelhado: indica p. H<5, portanto + para fermentação ácido mista (geração de maior proporção de ácidos)

2. Produção de Indol Identificar bactérias entéricas que são capazes de degradar o aminoácido triptofano até indol através da ação enzimática da triptofanase Hidrolisar o triptofano com a produção de indol não é uma característica de todos os microrganismo, por isso pode ser utilizado como marcador bioquímico

2. Produção de Indol

2. Produção de Indol 2 x Incubar à 30°C por 48 h Caldo Indol Triptona Na. Cl Água destilada 5 g 2, 5 g 1 L Adição de 0, 5 ml do reagente de Kovac + Leitura

3. Hidrólise do amido O amido juntamente com a celulose são os dois polissacarídeos naturais mais abundantes Forma linear da molécula do amido Forma ramificada da molécula do amido O que diferencia estes polissacarídeos são as ligações entre as moléculas de glucose As enzimas amilase e oligo-1, 6 -glicosidase catalisam a hidrólise do amido, formando maltose. A maltose pode então entrar na célula, onde é hidrolisada à glicose

3. Hidrólise do amido Diferencia bactérias que hidrolisam o amido Iodo presente na solução é usado para detectar a presença ou ausência de amido na periferia ao redor do crescimento bacteriano Iodo reage com o amido e produz uma coloração azulviolácea intensa Leitura Zona clara ao redor do crescimento representa resultado positivo para o teste

3. Hidrólise do amido 1ª Etapa do experimento 1) Abrir a placa com meio ágar amido próximo ao gramado atrás e a frente do prédio da Eng. Ambiental; 2) Deixar aberto por 10 minutos. 5 -10 ml 2ª Etapa do experimento Reativo Lugol (contém iodo) Incubar à 30°C por 48 h SE (+) Meio ágar amido Amido Na 2 HPO 4 Extrato de carne Na. Cl Agar Água destilada 2 g 1 g 10 g 5 g 15 g 1 L SE (-)

3. Hidrólise do amido AMIDO + DEXTROSE MALTOSE GLICOSE LUGOL + LUGOL Azul 5 -10 ml Reativo Lugol (contém iodo) Incolor SE (+) SE (-)

4. Oxidação/Fermentação CARBOIDRATO S Fermentação Produtos ácidos Aerobiamente O teste de oxidação/fermentação é utilizado para diferenciar microrganismos que oxidam ou fermentam açúcares específicos e determina se a bactéria é aeróbia ou anaeróbia facultativa

4. Oxidação/Fermentação Azul de bromotimol Tubos selados com óleo mineral (ambiente anaeróbio) Microrganismos são capazes de degradar o açúcar (alteração no p. H) Microrganismos não são capazes de degradar o açúcar (sem alteração do p. H)

4. Oxidação/Fermentação Azul de bromotimol Microrg. capazes de promover apenas oxidação Microrg. capazes de oxidar e fermentar Microrg. capazes de promover apenas fermentação

4. Oxidação/Fermentação Aeróbio Rodilhão de algodão 2 X Leitura Incubar à 30°C por 48 h Anaeróbio 2 ml de óleo mineral Meio com ágar e azul de bromotimol Corrigir o p. H para 7, 1 Na. Cl Peptona Glicose Ágar Azul de Bromotimol Água destilada 5, 0 g 2, 5 g 10 g 5 g 40 ml (solução 1: 500) 1000 m. L + -

4. Oxidação/Fermentação

5. Catalase Permite identificar microrganismos produtores da enzima catalase que protege a célula de formas tóxicas do oxigênio. A toxicidade do oxigênio para anaeróbios estritos deve-se a certas moléculas produzidas durante as reações que envolvem o oxigênio.

5. Catalase Reações tóxicas do oxigênio para anaeróbios estritos Adição de 1 elétron a molécula de oxigênio: O 2 + e- O 2 Superóxidos dão origem: 2 O 2 - + 2 H+ O 2 + H 2 O 2 Peróxido de hidrogênio O 2 - + H 2 O 2 O 2 + OH- Hidroxilas Altamente reativos e podem destruir componentes vitais da célula, como o DNA

5. Catalase Reações de proteção dos aeróbios e anaeróbios facultativos: Produção de enzimas que eliminam os superóxidos e peróxidos de hidrogênio: Enzimas Superóxido O 2 - H 2 O 2 Superóxido dismutase Catalase Peroxidase H 2 O 2 Peróxido de hidrogênio O 2 e H 2 O H 2 O

5. Catalase Água oxigenada (3%) Incubar à 30°C 18 -24 h Ágar nutriente Água oxigenada reage com a catalase liberando bolhas de oxigênio (Catalase +)

RESUMO GERAL Fermentação de Carboidratos Produção de Indol Cor amarela: indica p. H>5 Degradação do aminoácido triptofano até indol através da ação enzimática da triptofanase Cor avermelhada: indica p. H<5 F. Ácido F. de mista butanediol + Leitura Hidrólise de amido Detecção da presença ou ausência de amido na periferia ao redor do crescimento bacteriano Fermentação/ Oxidação Degradação do açúcar (alteração no p. H) Incapacidade de degradar o açúcar (sem alteração do p. H) + - Catalase Reação da água oxigenada com a enzima catalase liberando bolhas de oxigênio (Catalase +)

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