Aula de enzimologia Tema Cintica enzimtica Prof Adriane

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Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia

Aula de enzimologia Tema Cinética enzimática Prof. Adriane M. F. Milagres Departamento de Biotecnologia - Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo – USP adriane@debiq. eel. usp. br

Cinética das reações catalisadas por enzimas 1. Efeito da concentração de substrato Conteúdo: •

Cinética das reações catalisadas por enzimas 1. Efeito da concentração de substrato Conteúdo: • Cinética de uma reação simples • Determinando Vmax e Km • Significado de Km • Cinética do tipo cooperativo

A atividade de uma enzima e a concentração do substrato não são, em geral,

A atividade de uma enzima e a concentração do substrato não são, em geral, proporcionais Qual a porcentagem dos sítios ativos estão ocupados?

Por que estudar a cinética enzimática? • Determinar as constantes cinéticas do S e

Por que estudar a cinética enzimática? • Determinar as constantes cinéticas do S e dos inibidores • Ajudar a elucidar os mecanismos de reação • Determinar a função de uma enzima em uma rota metabólica • Conhecer as condições ótimas de catálise

A velocidade da reação é proporcional a S

A velocidade da reação é proporcional a S

Hipótese de equilíbrio rápido e estado estacionário O modelo de Michaelis-Menten é útil para

Hipótese de equilíbrio rápido e estado estacionário O modelo de Michaelis-Menten é útil para explicar a cinética das reações catalisadas por enzimas. O modelo de Michaelis-Menten considera que uma reação enzimática ocorre em dois passos: V = k 3 [ES] K 1 [E] [S] = K 2 [ES] K 2 = [E] [S] K 1 [ES]

1) V = k 3 [ES] 2) [Et] = [E] + [ES] V =

1) V = k 3 [ES] 2) [Et] = [E] + [ES] V = k 3 [ES] [Et] [E] + [ES] [E] [S] V = K 3 ks Et E + [E] [S] ks V= Vm [S] ks + [S] K 2 = Ks = [E] [S] K 1 [ES] = [E] [S] ks

Hipótese de Briggs - Haldane ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma

Hipótese de Briggs - Haldane ETAPA 1. Ligação de um substrato (S) a uma enzima (E), formando um complexo intermediário (ES) ETAPA 2. Formação do produto (P) a partir do complexo ES, com recuperação da forma livre da enzima (E)

A reação do anterior está representada no equilíbrio: onde k 1, k 2, k

A reação do anterior está representada no equilíbrio: onde k 1, k 2, k 3 e k 4 são as constantes de velocidade de cada etapa. Nesse caso, a da reação(V), ou seja, a velocidade de formação do produto será:

Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação: A velocidade inicial de reação neste

Porém, no estado inicial, podemos simplificar a reação: A velocidade inicial de reação neste caso é dada por: Na análise cinética da reação catalisada por uma enzima, consideramos apenas o ESTADO ESTACIONÁRIO, que é aquele em que, apesar de estarem mudando as concentrações de S (diminuindo) e de P (aumentando), não há variação da concentração dos intermediários da reação.

Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES ou. . . k

Velocidade de formação de ES =Velocidade de decomposição de ES ou. . . k 1[E]. [S] = (k 2+ k 3)[ES] (eq. 3) A equação 3 pode ser re-arranjada em: Para simplificar a equação 4, foi definida uma constante, Km, conhecida como Constante de Michaelis:

No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e

No numerador, temos duas constantes de velocidade de reações de DECOMPOSIÇÃO de ES e no denominador, a constante de velocidade da FORMAÇÃO de ES. Dessa forma, Km é uma medida da AFINIDADE da enzima pelo substrato. Km ALTO = Baixa afinidade e Km BAIXO = Alta afinidade

Como toda a enzima que estiver na solução de reação (ETOTAL) corresponde à soma

Como toda a enzima que estiver na solução de reação (ETOTAL) corresponde à soma das espécies E (enzimas livres) e ES (enzimas no complexo com substrato), Podemos substituir esta equação na da velocidade inicial da reação é Vo = k 3. [ES]:

Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a velocidade máxima

Quando todas as enzimas estão na forma de complexo ES, atingimos a velocidade máxima de reação, ou seja, se [E]TOTAL= [ES], então a equação 10, pode ser representada por: • Se [S]<<<Km, então: Vo = Vmax [S] Km • E se [S] >>>> Km, Vo = Vmax Vo = K[S] V 0= k 3[E]TOTAL • Se V 0=Vmáx/2, temos: Km = [S]. Ou seja, Km corresponde à concentração de S necessária para se atingir a metade da velocidade máxima!

Significado de Km • Importante parâmetro da reação enzimática e da função biológica •

Significado de Km • Importante parâmetro da reação enzimática e da função biológica • Fornece uma medida da [S] para que ocorra uma catálise significativa • Km esta relacionado as constantes de velocidade de cada etapa da reacão

Significado do kcat/KM: A Eficiência Catalitica • É uma medida de eficiência da Enzima

Significado do kcat/KM: A Eficiência Catalitica • É uma medida de eficiência da Enzima • Permite comparar a preferência de uma Enzima para diferentes Substratos

Significado do kcat/KM: A perfeição cinética

Significado do kcat/KM: A perfeição cinética

Determinação experimental dos parâmetros cinéticos Diagrama Lineweaver-Burk (Duplo-Recíproco) As concentrações de substrato escolhidas devem

Determinação experimental dos parâmetros cinéticos Diagrama Lineweaver-Burk (Duplo-Recíproco) As concentrações de substrato escolhidas devem ser proximas do Km

Críticas ao gráfico L. B. 1) 2) 3) Aumentos iguais de S que fornecem

Críticas ao gráfico L. B. 1) 2) 3) Aumentos iguais de S que fornecem pontos igualmente espaçados no grafico V x S não fornecem pontos igualmente espaçados no L. B. Valores tendem a se agrupar próximo ao eixo 1/v e aparecem poucos pontos mais altos da escala e são os que devem pesar no traçado da reta Pequenos erros na determinação de V se tornam maiores quando se calcula o seu recíproco.

û Gráfico de Eadie-Hofstee Não envolve o recíproco de V e podem tornar mais

û Gráfico de Eadie-Hofstee Não envolve o recíproco de V e podem tornar mais precisos Vmax v Inclinação = -Km Vmax Km v [S]

û Gráfico de Hanes-Woolf Mais indicado para dados obtidos com aumentos iguais de S

û Gráfico de Hanes-Woolf Mais indicado para dados obtidos com aumentos iguais de S [S] v Inclinação = 1 Vmax Km Vmax -Km [S]

Exercício: 1) Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima que catalisa a reação

Exercício: 1) Os seguintes dados foram obtidos para uma enzima que catalisa a reação S-P. As concentrações de substrato abrangem uma faixa bastante ampla para nos permitir utilizar qualquer um dos gráficos lineares. Trace os gráficos e determine Km e Vmax. [S] (M) V (nmoles/L/min) 8, 33 10 -6 13, 8 1 10 -5 16 1, 25 10 -5 19 1, 67 10 -5 23, 6 2 10 -5 26, 7 2, 5 10 -5 30, 8 3, 33 10 -5 36, 3 4 10 -5 40 5 10 -5 44, 4 6 10 -5 48 8 10 -5 53, 4 1 10 -4 57, 1 2 10 -4 66, 7

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO Este gráfico mostra como varia a velocidade inicial de uma reação com o aumento da concentração de substrato: Ou seja, Vmáx e Km podem ser calculados quando V 0 é medida em função de várias concentrações de substrato. 1) Quando [S] é muito grande – 2) V = Vmax P = Vmax. t

Ordem da reação 2) Quando S é muito pequeno Vo = Vmax [S] Km

Ordem da reação 2) Quando S é muito pequeno Vo = Vmax [S] Km Vo = K[S] K é uma constante de primeira ordem (min -1) -d. S = k. S dt

Exercício: 1) Uma enzima teve sua atividade determinada a uma concentração inicial de [S]

Exercício: 1) Uma enzima teve sua atividade determinada a uma concentração inicial de [S] de 2 x 10 -5 M. Em 6 min, metade do substrato foi utilizado. O Km para o substrato é de 5 x 10 -3 M. Calcule a) k, b) Vmax, c) concentração de produto formado em 15 min.

Enzimas Alostéricas • Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten • Quanto maior a [S]

Enzimas Alostéricas • Não obedecem a Cinética de Michaelis-Menten • Quanto maior a [S] maior será a atividade da E até esta alcançar o Vmax • A curva da V versus [S] e sigmóide • Segue modelo da curva de saturação da Hemoglobina com O 2 • Sistema cooperativo

Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo e se liga um efetor

Enzimas alostéricas possuem uma região diferente do sítio ativo e se liga um efetor ou modulador alostérico. A mudança conformacional decorrente da ligação do efetor alostérico se propaga pela molécula e afeta o sítio ativo, ativando-o ou inibindo-o. Ativador alostérico Inibidor alostérico Gráfico V x S é uma curva sigmóide

Enzimas com sítios múltiplos 1) Sitios independentes (hiperbólica) 2) Sítios interdependentes (Sigmoidal) Enzimas tipo

Enzimas com sítios múltiplos 1) Sitios independentes (hiperbólica) 2) Sítios interdependentes (Sigmoidal) Enzimas tipo V: efetores alostéricos alteram a Vmax - hiperbólica Enzimas tipo K: efetores alostéricos alteram o Km - Cinética sigmoidal (indica cooperatividade)

k’ k 3 E + h. S ------ ESh ------- ESh-1 + P V

k’ k 3 E + h. S ------ ESh ------- ESh-1 + P V = k 3 [ESh] (1) Et = [E] + [ESh] = [E] [S]h / k’ V = k 3 [ESh] Et [E] + [ESh] V = k 3 [E] [S]h / k’ Et [E] + [E] [S]h / k’ V = k 3 [S]h [Et] k’ + [S]h V = Vm [S]h K’ + [S]h

Equações de V x [S] é a concentração de substrato S 50 é a

Equações de V x [S] é a concentração de substrato S 50 é a concentração de substrato para a qual a enzima está hemisaturada e em que a velocidade é metade de Vmax. h é o coeficiente de Hill e é uma medida do grau de cooperatividade (ou sigmoidicidade): quando h=1 a equação acima simplifica e é igual à equação de Michaelis-Menten (ausência de cooperatividade).

A equação de Hill também é linearizável: V= Vm [S]h K’ + [S]h Rearranjando:

A equação de Hill também é linearizável: V= Vm [S]h K’ + [S]h Rearranjando: v. K’ + v[S]h = Vm [S]h Vk’ = Vm[S]h –v[S]h Vk’ = (Vm – v) [S]h V = [S]h Vm – V k’ Log ( V ) = h log [S] - log k’ ( Vm – V ) (Equação de Hill)

Exercício: Determine se a enzima obedece uma cinetica hiperbólica ou sigmoidal e calcule ou

Exercício: Determine se a enzima obedece uma cinetica hiperbólica ou sigmoidal e calcule ou estime as constantes cinética apropriadas (Km, Vmax ou K’ [S]0, 5 , nap e Vmax) [S] (M x 104) 6, 5 12, 5 25 50 100 200 400 800 V (micromoles/L/min) 1, 54 5, 88 20 50 80 94, 12 98, 46 99, 61

Considerações finais: 1) O estudo cinético de uma enzima nos informa sobre o modo

Considerações finais: 1) O estudo cinético de uma enzima nos informa sobre o modo como a atividade da enzima se modifica quando se alteram as condições do meio em que esta é ensaiada. 2) O estudo cinético de uma enzima é importante para caracterizar essa enzima, desta maneira distinguindo-a funcionalmente das demais enzimas inclusive das que podem catalisar a mesma reação. 3) O desenho de condições de ensaio adequadas à dosagem de uma enzima numa preparação biológica complexa é feita com base em estudos de cinética.