Aseguramiento de calidad MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

Aseguramiento de calidad MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Norma ISO 17025 Bqca. QM Alicia I. Cuesta, Consultora Internacional de la FAO

Objetivos de la clase: 1. Preparación de medios de cultivo y reactivos. 2. Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes. 3. Evaluación de la calidad de los medios de cultivo: Norma ISO/TS 11133 -2: 2000

REQUISITO: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los medios de cultivo y reactivos sea apropiada para los ensayos realizados. Este es un punto crítico! ¿Cómo se asegura su calidad?

¿Qué necesita un microorganismo para crecer? 1. Medios de cultivo: Son necesarios para el aislamiento, mantenimiento, la reproducción y la identificación de los microorganismos. ☺Contienen sustancias nutritivas ☺p. H adecuado ☺Deben estar estériles. 2. Incubación: Depende del metabolismo del microorganismo a cultivar. ☺La atmósfera empleada. (aerobio, microaerofílico, anaerobio) ☺Tiempo. ☺Temperatura.

Medios de cultivos Clasificación de medios de cultivo: 1. Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos. 2. Según su finalidad en microbiología: FNo selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos. FSelectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de microorganismo. FEnriquecido: son medios no selectivos que se le agrega sustancias como ser sangre, suero, albúmina, etc. . . Para microorganismos exigentes. FDiferenciales: son medios de cultivo que permiten establecer diferencias entre diferentes tipos microorganismos.

Medios de cultivo Los requerimientos de los medios de cultivo son específicos de : Fla muestra que se analiza. F de los microorganismos a ser detectados.

Los medios de cultivo se preparan: 1. En el laboratorio a partir de sus diferentes componentes. 2. A partir de productos en polvo deshidratados comerciales o 3. Pueden adquirirse medios listos para su uso. Se puede tomar como base el documento ISO 7218: 1996(E) Microbiology of food animal feeding stuff-General rules for microbiological examinations para: -La preparación y esterilización de medios. -Tiempos de almacenamiento recomendados.

Requisitos de los medio de cultivo provistos por el fabricante : ü Los lotes de medios deben estar debidamente identificados. ü Cada lote recibido debe ir acompañado de evidencias del cumplimiento de las especificaciones de calidad.

REQUISITO: El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo debe proveer información acerca de las especificaciones de calidad, como mínimo debe incluir lo siguiente: • Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier suplemento. • Fecha de vencimiento del medio. • Condiciones de almacenamiento. • Control de esterilidad. • Control del crecimiento de los microorganismos de interés (target) y de los microorganismos no deseados (no target) y criterios de aceptabilidad. • Controles físicos y criterios de aceptabilidad aplicados. • Fecha de emisión de las especificaciones

Manejo de los medios de cultivo: 1. ü ü ü El laboratorio debe registrar la fecha : de recepción de apertura del envase. de caducidad 2. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones apropiadas. ü Envases: deben estar herméticamente cerrados. (especialmente medios deshidratados) ü No deben utilizarse medios deshidratados que presenten apelmazamiento o un cambio de color.

Control de calidad del agua destilada Para la preparación de medios, soluciones y tampones, debe utilizarse agua destilada que haya sido sometida a controles periódicos que aseguren su calidad. Controles periódicos: üRequisitos del agua destilada: -Conductividad. - p. H - Contaminación microbiana - Libre de sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes. -Se debe llevar un registro actualizado de los mismos.

Procedimiento para preparación de medios de cultivo, diluyentes y reactivos Los medios de cultivo, soluciones y reactivos deben prepararse, almacenarse y utilizarse de acuerdo con un procedimiento documentado. üEn dicho procedimiento debe haber una descripción del equipamiento necesario. üEl laboratorio debe colocar una etiqueta indicando la identificación y otros datos en los medios de cultivo y reactivos. üDebe haber un registro de preparación de medios de cultivo y reactivos.

Almacenamiento de los medios de cultivo y diluyentes preparados: Debe determinarse y verificarse el período de validez de los medios preparados en las condiciones de conservación especificadas. En general los medios preparados se guardan: üEn heladera no más de tres meses üA temperatura ambiente no más de un mes en condiciones que impidan que su composición sea modificada. Observar cambio del color, evaporación, la deshidratación o el crecimiento microbiano.

REQUISITOS Medios preparados por el laboratorio: Se debe verificar (siempre que sea necesario) que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el laboratorio tengan las características adecuadas con respecto a: üRecuperación o supervivencia de los microorganismos de interés. (Productividad) üInhibición o supresión de los microorganismos no deseados. (Selectividad) üPropiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas) üPropiedades físicas (por ejemplo, p. H, volumen). üSea estéril.

Medio de cultivo: Parámetros a tener en cuenta para obtener un buen resultado. üAgua: recipientes dónde se almacena el agua debe ser inerte. üp. H: la medida a 25 o. C. p. H +0. 2. ajuste el p. H con 1 M Na. OH o 1 M CLH üfundir en el agua hirviente volúmenes <500 ml. ü 15 ml de espesor agar en placas petri 90 mm. üSecado de placas estufa 25 -55 o. C (20 min. ) o en flujo laminar. üIncubación: las pilas de platos < 6.

Medios listos para su uso: Todos los medios y diluyentes que se suministren en una forma directamente utilizable o parcialmente completa deben ser validados antes de su utilización. Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a: F la recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés F la inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser cuantitativa. F los atributos (por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas). Parte de esa validación es provista por las especificaciones de calidad del proveedor.

Reactivos EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS REACTIVOS: El laboratorio debe asegurarse que la calidad de los reactivos utilizados sea apropiada para los ensayos realizados. Ejemplo: Reactivos usados para revelar pruebas bioquímicas Realizo controles positivo y negativo utilizando microorganismos que sean trazables a colecciones de cultivos nacionales o internacionales reconocidas.

Control de las pérdidas de volumen durante la esterilización: Debe verificarse que no haya pérdidas significativas de volumen de los diluyentes durante el proceso de esterilización en autoclave. Este punto es especialmente importante en métodos cuantitativos. El laboratorio debe tener : FUn procedimiento documentado. FRegistro de datos obtenidos realizados en forma periódica. El laboratorio determina el intervalo en el que se efectúan estos controles.

Control de las pérdidas de volumen durante la esterilización Para la evaluación de la pérdida de volumen de los diluyentes: 1. Colocar un volumen fijo de diluyente en tubos de ensayo o frascos de dilución. 2. Medir el peso o volumen antes y después del proceso de esterilización en autoclave. 3. Con los datos obtenidos, se efectúa el cálculo y la inferencia estadística.

LAVADO DE MATERIAL: Otro aspecto a tener en cuenta es el correcto lavado del material reciclable. El laboratorio de debe contar con un instructivo para esta tarea. Pasos: ☺Descontaminación material de vidrio. ☺Enjuague y se lavado con agua caliente y extran neutro (diluido al 2%) ☺Enjuague nº de veces con agua corriente y luego un nº de veces con agua destilada. Eliminar el detergente ☺El material se seca en estufa y se acondiciona para ser esterilizado.

Eliminación de los reactivos: Si bien la eliminación adecuada de los reactivos no es un problema que afecte directamente a la calidad, DEBE REALIZARSE DE ACUERDO CON LA NORMATIVA VIGENTE EN MATERIA DE MEDIO AMBIENTE, SALUD Y SEGURIDAD. Las precauciones a tomar con suplementos conteniendo sustancias tóxicas se especificarán claramente en cada caso de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Control de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes: ¿ Fue efectivo el proceso de esterilización de los medios de cultivo y diluyentes? PRUEBA: se incuban en estufa de cultivo. • La temperatura y tiempo de incubación para esta prueba se corresponden con las condiciones usadas durante el ensayo. • Se realiza este ensayo sobre el 1% de las placas o tubo del comienzo y 1% de las placas o tubos del final de verter o distribuir los medios o diluyentes. • Este procedimiento se realiza por cada vez que se esteriliza un lote de medio de cultivo o diluyente en autoclave o se esteriliza por filtración.

REGISTRO CONTROL DE ESTERILIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Datos a registrar: ü Fecha de realización del control ü Medio de cultivo o diluyente ü Indicación del proceso de esterilización (Ejemplo N º correlativo de proceso en autoclave o filtración) ü Tiempo de incubación (en horas) ü Temperatura de incubación (º C) ü Resultado ü Conforme (SI o NO) ü Firma del personal responsable de la realización del control.

Síntesis parcial En microbiología se le da especial énfasis a la calidad de los medios de cultivo y reactivos, tal que aquella sea apropiada para los ensayos realizados. La preparación y esterilización constituyen pasos críticos en el logro de este objetivo. El fabricante en el momento de la entrega de medio de cultivo debe proveer información acerca de las especificaciones de calidad. El laboratorio debe contar con Procedimientos o Instructivos documentados e implementado para : FLa preparación y esterilización de medios de cultivo y diluyentes FLa preparación de reactivos FControl de calidad del agua destilada. F Lavado de material FControl de las pérdidas de volumen de los diluyentes durante la esterilización en especial para métodos cuantitativos.

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: El objetivo es definir la: metodología para evaluar la PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de microbiología.

PRODUCTIVIDAD: Definición: rendimiento, recuperación, crecimiento de un microorganismo que se espera que desarrolle en el medio de cultivo. Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de referencia target para evaluar la productividad (ver anexo B de la norma ISO/TS 11133 -2: 2000) EJEMPLO: En un medio de cultivo no selectivo como por ejemplo el PCA se evalúa el adecuado desarrollo de las cepas target o blanco. En este caso se usan E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538 y B. subtilis ATCC 6633

Selectividad: Definición: la supresión del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de cultivo. Según el medio se usa una cepa apropiada de referencia no-target para evaluar la selectividad (ver anexo B de la norma ISO/TS 11133 -2: 2000) En un medio de cultivo selectivo como por ejemplo Caldo Lauril sulfato (LST) se evalúa el desarrollo de las cepas target y no target. En este caso las cepas target que se usan son E. coli ATCC 25922, C. freundii ATCC 43864 y las cepas no target Enterococcus faecalis ATCC 29212. Evalúa reacciones características: gas y turbidez.

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar: FEl crecimiento de las cepas target FHay que prestar atención también a la apariencia, tamaño y morfología de las colonias (especificidad) FEl crecimiento de las cepas no-target debe estar en parte o completamente inhibido.

PARA EVALUAR CADA LOTE DE MEDIO DE CULTIVO según Norma ISO/TS 11133 -2: 2000 SE PUEDE EMPLEAR LOS SIGUIENTES MÉTODOS: a)Pruebas cuantitativas b) Pruebas semi-cuantitativas c) Pruebas cualitativas

EVALUACIÓN DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: La elección del empleo de una u otra metodología será considerada en cada caso en particular según el medio a evaluar, las capacidades y necesidades del laboratorio ver ANEXO B norma ISO/TS 11133 -2: 2000.

MEDIO DE REFERENCIA El uso de un medio de referencia específico es obligatorio en los métodos de cuantitativos (ver anexo B de la norma ISO/TS 11133 -2: 2000) Para las pruebas semi-cuantitativas o cualitativas, el uso de un medio específico de referencia o un medio de cultivo que da una “la reacción positiva" ayuda al ínterpretar los resultados. El medio de referencia debe ser de conocida buena calidad (por ejemplo ser un medio listo para el uso de calidad asegurada por el proveedor)

Cultivo de trabajo: (según Instructivo de cultivos de referencia) Se prepara un cultivo en fase estacionaria de la cepa a partir de la cepa de reserva almacenadas en el laboratorio en un caldo no selectivo. (por ejemplo caldo cerebro corazón)

Productividad: Para evaluar la productividad de los medios de cultivo sólido, semisólido o líquidos ya preparados esterilizados, los mismos deben ser inoculados con un microorganismo target apropiado o cultivo de trabajo.

Productividad: Pruebas cuantitativas Para las pruebas cuantitativas la proporción de Productividad PR es definido como sigue: PR = Ns /No donde Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo a probar (obtenido de uno o más placas) No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser › 100 ufc.

Productividad: Pruebas cuantitativas CRITERIO DE CONFORMIDAD: Anexo B de la norma ISO/TS 11133 -2: 2000. Allí figuran: F Los microorganismos FTiempo y temperatura de incubación FCriterios FMedio de referencia que debe usarse según el medio a evaluar. F PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que el medio de cultivo sea conforme. En general para que los medios no selectivos como el PCA sea conforme, el PR debe ser › a 0, 7.

Productividad: Pruebas cuantitativas Ejemplo Se desea evaluar la productividad del PCA. El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA) 1) Ns ( dil -6): 140 ufc No ( dil -6): : 170 ufc PR = Ns /No PR= 0, 8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme 2) Ns ( dil -6): 100 ufc No ( dil -6): 230 ufc PR = Ns /No PR= 0, 4 esto quiere decir que el medio testeado no es conforme en cuanto a su productividad.

Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de cultivos sólidos • Se inocula en forma de estrías diluciones del cultivo con ansa calibrada de acuerdo a la figura o modelo. • Las placas inoculadas se incuban a temperatura y tiempo que depende del medio de cultivo evaluado y se observa el crecimiento. • Se evalúa la productividad del medio teniendo en cuenta el valor de cada estría con crecimiento.

Productividad : Pruebas cualitativas Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de crecimiento. Score para medios sólidos: • 0 no hubo crecimiento • 1 hubo crecimiento débil • 2 hubo buen crecimiento. Score para medios líquidos: • 0 no hubo turbidez • 1 hubo turbidez muy tenue • 2 hubo buena turbidez

Selectividad: Para llevar a cabo la prueba de la selectividad, el medio de cultivo selectivo a evaluar y un medio de la referencia se inoculan con un microorganismo y nivel apropiado. Se emplea una suspensión del microorganismo de no-target que contiene 104 cfu a 106 cfu por ml se inocula en la placa o en el tubo de medio.

Certificado de control de calidad de un no selectivo medio de cultivo

Certificado de control de calidad de un selectivo medio de cultivo

Certificado de control de calidad de un selectivo medio de cultivo

REGISTRO EVALUACION DE MEDIOS DE CULTIVO La información a registrar es: ü Medio de cultivo evaluado. ü Nº ID o Nº lote de medio evaluado. ü Fecha de realización del análisis. ü Cepa usada (Género y especie del microorganismo y tipo y Nº de colección). ü Medio de referencia usado para evaluar la productividad. ü Medio de referencia usado para evaluar la Selectividad. ü Resultado de productividad (unidades). ü Resultado de selectividad (unidades). ü Medio de cultivo conforme (SI/NO) ü Personal responsable.

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo Posibles problemas Anormalidad Posible causa Falla en la solidificación del medio sólido p. H incorrecto üSobrecalientamiento del medio durante la preparación üPeso incorrecto del agar üAgar mal disuelto o incompleta mezcla de los ingredientes Color anormal üSobrecalientamiento del medio durante la preparación üp. H incorrecto üContaminación externa. üPobre calidad del agua o del medio deshidratado. üPobre calidad del agua. üPobre calidad del medio deshidratado. üp. H medido incorrectamente. üContaminación externa con químicos. üSobrecalientamiento del medio durante la preparación

Aseguramiento de calidad de los medios de cultivo Posibles problemas Anormalidad Formación de precipitado Posible causa üSobrecalientamiento del medio durante la preparación üp. H medido incorrectamente üPobre calidad del agua. üPobre calidad del medio deshidratado. Medio inhibitorio/ Productividad baja üPobre calidad del agua. üFormulación inadecuada Ej. ingredientes y suplementos mal pesados. üSobrecalientamiento del medio durante la preparación üPobre calidad del medio deshidratado Selectividad pobre üSobrecalientamiento del medio durante la preparación üp. H incorrecto. üFormulación inadecuada. üPobre calidad del medio deshidratado. üSuplementos agregados incorrectamente Ej: con el medio demasiado caliente o en alta proporción.

Síntesis parcial Los medios de cultivos sólidos, semisólidos y líquidos empleados para la realizar el ensayo deben ser evaluados en cuanto a su productividad, selectividad y reacciones características. Para ello se han desarrollado pruebas cuantitativas, semi-cuantitativas y cualitativas. Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditación se basan en la Norma ISO/TS 111332: 2000. Es importante el uso de cultivos de referencia con adecuada trazabilidad.

Síntesis final Un punto crítico a tener en cuenta a la hora de implementar y la ISO 17025 y acreditar el laboratorio es la preparación, esterilización y evaluación de la calidad de los medios de cultivo empleados para realizar el ensayo. Las recomendaciones internacionales de organismos de acreditación se basan en la Norma ISO/TS 11133 -1: 2000 y ISO/TS 11133 -2: 2000. Esto implica una revisión de las prácticas cotidianas realizadas por el laboratorio y a su vez la seguridad que los medios usados son adecuados a la finalidad prevista.