Arbeitsanweisungen zur Durchfhrung des DNAFingerprintingExperiments 1 1 Ansetzen

Arbeitsanweisungen zur Durchführung des DNA-Fingerprinting-Experiments 1

1. Ansetzen der Restriktion 2

1. 1 Beschriften der Tubes Beschriftung TO DNA [µl] 10 V 1 V 2 V 3 V 4 V 5 10 10 10 Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V 1 - V 5) 3

1. 2 Zugabe von 10 µl Enzymmix (E) [µl] TO V 1 V 2 V 3 V 4 V 5 10 10 10 Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V 1 – V 5) 4

2. Restriktionsverdau 20 Minuten bei 37 o. C im Thermoblock Modell: 5

3. Während des Restriktionsverdaus Elektrophorese vorbereiten 6

3. 1 Vorbereiten der Kammer Einsetzen des Schlittens, der Metallkeile und des Kamms in die Elektrophoresekammer 7

3. 2 Herstellen des Agarosegels (0, 8%) • 0, 24 g Agarose (AG) + 30 ml TAE-Puffer (1 x) • Gemisch in der Mikrowelle kurz aufkochen, umschwenken und erneut kurz zum Kochen bringen Gel muss schlierenfrei sein! 8

3. 3 Befüllen der Gelkammer • Gel auf ca. 55 o. C abkühlen lassen (Handrückentest) und gießen Abb. : Gießen des Agarosegels in die Kammer Achtung: Kammer bis zum Erstarren des Gels nicht mehr bewegen 9

3. 3 Befüllen der Gelkammer • Nach Erstarren des Gels, Metallkeile entfernen • Gel mit ca. 270 ml TAEPuffer (1 x) überschichten • Kamm ziehen Achtung: die Taschen müssen frei von Luftblasen sein 10

4. Vorbereiten des Längenstandards M • Zu 10 µl Längenstandard (M) werden 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert Inhalt (20 µl) gut vermischen 11

5. Zugabe des Ladepuffers 10 µl • In die Tubes TO und V 1 – V 5 werden jeweils 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert • Inhalt (30 µl) gut vermischen 12

6. Füllen der Geltaschen Linke Randspur bleibt frei Je 20 µl der Proben TO und V 1 – V 5 bzw. 20 µl Längenstandard (M) in jeweils eine Geltasche pipettieren Spuren: von links nach rechts Reihenfolge beachten!!! 13

6. Füllen der Geltaschen Achtung: Geltasche darf dabei nicht durchstoßen werden 14

7. Gelelektrophorese Verschließen der Elektrophoresekammer: Kathode (-) nahe den Geltaschen Anode (+) gegenüber Spannung: 180 V Modell:

8. Färben der DNA • Entnahme des Gelschlittens aus der Elektrophoresekammer • Gel in Färbeschale überführen und mit 100 ml Färbelösung (50 x) für 2 Minuten färben • Färbelösung abgießen (kann wieder verwendet werden) • Entfärben des Gels durch zweimaliges Wässern in 45 o. C warmen Wasser 16

TO V 1 V 2 V 3 V 4 V 5 M 9. Ergebnis der Gelelektrophorese Wer ist der Täter ? 17