Aprenent de lestudi clnic del TGN 1412 Grup

Aprenent de l’estudi clínic del TGN 1412 Grup A

TGN 1412 Anticòs monoclonal humanitzat superagonista de CD 28 Estructura tipus immunoglobulina (Ig. G 4) Tractament contra malalties autoimmunes i alguns càncers Accions: Activació dels L. T reguladors Downregulation del S. I. Activació dels L. T Secreció de citoquines

Estructura immunoglobulina Segons la cadena constant 5 isotips: Ig. M, Ig. G, Ig. A, Ig. E, Ig. D

Immunoglobulina: regions hipervariables Regions hipervariables cadenes pesades: • CDR 1: residus 31 -35 • CDR 2: residus 50 -65 • CDR 3: residus 95 -102 Regions hipervariables cadenes lleugeres: • CDR 1: residus 24 -34 • CDR 2: residus 50 -56 • CDR 3: residus 89 -97

Classificació estructural de proteïnes Root: Scop Class: All beta proteins Fold: Immunoglobulin-like beta-sandwich SCOP (Structural Classification of Proteins) Superfamily: Immunoglobulin Jerarquia en la classificació de dominis proteics Family: Manual! V el set. PDB domains (antibody variable domain-like) Base de dades basada en C 1 set domains (antibody constant domain-like) CLASSE PLEGAMENT SUPERFAMILIA H O M O L O G I A - +

• Fase clínica I: L’administració de 0. 1 mg/kg en sis voluntaris sans provoca: – Increment en sang de TNFα, IFNγ i citoquines proinflamatòries desencadenant una fallida multiorgànica. Per què? Èmfasi en estudiar l’estructura del superanticòs TGN 1412 i el seu receptor

Acció TGN 1412: activació de cèl·lules T TCR APC T Activació completa Activació parcial Pèptid antigènic T TGN 1412 MHC CD 28 APC T CD 80/86 CD 28 Activació completa Totes les cèl·lules T reguladores 50% de les cèl·lules T citotòxiques

Estructura CD 28 Els anticossos coestimuladors convencionals depenen de forma crítica de la cadena lateral del aa. 98 que és espècie específic. Aquest residu està adjacent al motiu MYPPPY que és on s’uneix el lligand (residus 99 -104). D’acord amb el model monòmer CD 28 humà que es basa en l’estructura de CTLA-4, els residus 60 -65 que formen l’epítop del superagonista es localitzen en el loop que hi ha entre la cadena C’’ i D a l’extrem del domini V de tipus Ig.

Importància de determinar l’estructura SEQÜÈNCIA ESTRUCTURA FUNCIÓ • El nº de plegaments és limitat • Seqüències similars presenten gairebé idèntiques estructures • Seqüències llunyanes comparteixen mateix plegament L’estructura està més conservada que la seqüència al llarg de l’evolució L’estructura ens pot ajudar a fer prediccions sobre funcions

Relació seqüència-estructura-funció L’estructura està més conservada que la seqüència al llarg de l’evolució

Tècniques per determinar l’estructura d’una proteïna • Estructura terciària o Cristal·lografia de Raigs X o RMN • Estructura secundària o Dicroisme circular o Espectometria d'infrarojos

Dicroisme circular Absorció diferencial entre la llum circularment polaritzada a una longitud d’ona determinada • Raig llum polaritzada • Descomposició vector intensitat • Oscil·lació del vector de la intensitat en 2 vectors que giren circularment del camp elèctric/magnètic en sentit contrari

Dicroisme circular Absorbància diferencial de la llum de dretes i esquerres efecte del DC Raig resultant : trajectòria el·líptica del vector d’intensitat Fonts de senyal Cromòfors units a centre quiral Disposició quiral dels cromòfors en estructura 3 D Compostos especulars senyal d’espectre especular

Espectrometria d’infraroig Limitat per espectre visible i microones. Freqüència vibracions àtoms enllaços peptídics diferent per cada estructura. Banda I (C=O) Molècula absorbeix IR canvia estat d’energia vibratòria. El seu origen en les vibracions moleculars dos tipus: Tensió Flexió

Modelatge del TGN 1412

Modelat TGN 1412 1. Cerca de proteïnes homòlogues o elecció de patrons - Psi-BLAST contra Swiss. Prot obtenció de la PSSM - Psi-BLAST contra PDB proteïnes homòlogues cristal·litzades 2. Alineament basat en seqüència (CLUSTALW) i en estructura (HMMER) 3. Realització del modelat de la proteïna (MODELLER) 4. Comparació model amb el patró (STAMP) 5. Optimització energètica del model (MODELLER) 6. Avaluació del model - Estereoquímica (PROCHECK) anàlisi mapa de Ramachandran - Energètica (PROSAII) anàlisi de les energies

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Psi-Blast

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) CLUSTALW:

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Modeller: model de seqüència:

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Avaluació estereoquímica model basat en seqüència (PROCHECK):

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Avaluació energètica model basat en seqüència (PROSAII): patró Model seqüència Valors de Z-score

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) HMMER:

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Modeller: model d’estructura:

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Avaluació estereoquímica model basat en estructura (PROCHECK):

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Avaluació energètica model basat en estructura (PROSAII): patró model estructura Valors de Z-score

Modelat TGN 1412: exemple Fab (HC) Comparació model seqüència i model estructura amb el patró RMS: 0. 83 RMS: 0. 79

Modelat TGN 1412: Fab cadena lleugera: model estructural RMS: 0. 83 Fc HC: model estructural RMS: 0. 88

Hipòtesis del cas TGN 1412

Hipòtesis • Reconeixement de Fc TGN 1412 per Fc. Rs • Diferències entre CD 28 humà i CD 28 macaca mulatta • Procés incorrecte d’humanització • TGN 1412 reconeix molècules amb domini Ig • Formació d’agregats • TGN 1412 + cells T memòria • No especificitat per una subpoblació de cells T

Reconeixement de Fc TGN 1412 per Fc. Rs

Reconeixement de Fc TGN 1412 per Fc. Rs Unió Fc – Receptor Fc Endocitosi del complexe immune Altres funcions efectores: • Regulació de la producció d’anticossos en cèl·lules B • Citotoxicitat • Activació d’altres mediadors inflamatoris Localització dels Fc. Rs: Mastòcits, macròfags, NK cells, monòcits, eosinòfils, neutròfils i plaquetes. Absents en els limfòcits

Reconeixement de Fc TGN 1412 per Fc. Rs Tempesta de citoquines provocada pel TGN 1412: possible interacció de la regió CH 2 de la Fc amb els receptors Fc. R Antecedents: cas OKT 3 (anti-CD 3) Tempesta de citoquines provocada per una elevada afinitat entre la regió CH 2 de la Fc amb receptors Fc

Estructura Fc. Rs • Tots els Fc. Rs tenen una estructura similar • Dos dominis de tipus Ig extracel·lulars, la unió dels quals es manté amb ponts d’H. • S’uneixen als dominis CH 2 (D 2) de les Ig

La principal unió en aquesta estructura és el “proline sandwitch”. La Pro-329 localitzada en el domini Cγ 2 -A de la Fc està col·locada entre els Trp-87 i Trp-110 del FCγRIII. Aquest motiu es troba en tots els FCγRs d’humans i murins. FCγR III TGN 1412 FC

La prolina 329 de la Fc de la Ig. G interacciona amb el Trp-87 i Trp-110 del FCγR

Modelatge interacció Fc. TGN 1412 -Fc. R PDB ID: 1 e 4 K CRYSTAL STRUCTURE OF SOLUBLE HUMAN IGG 1 FC FRAGMENT-FC-GAMMA RECEPTOR III COMPLEX Superposició models Fc TGN 1412 amb les Fc del pdb 1 e 4 k: • Obtenció alineament inicial basat en seqüència: T-Coffee • Canvi format de l’alineament a format bloc (aconvert) • Incorporació alineament al fitxer d’entrada • Execució de Stamp

CH 2 FCγR III CH 2 TGN 1412 FC

La prolina 93 de la Fc del TGN 1412 podria interaccionar amb el Trp-87 i Trp-110 del FCγR Fc del TGN 1412 podria interaccionar amb el Fc. R provocant la tempesta de citoquines

Diferències entre CD 28 humà i CD 28 macaca mulatta

Diferències entre CD 28 humà i CD 28 models animals Cloning, sequencing, and homology analysis of nonhuman primate Fas/Fas-ligand co-stimulatory molecules. Villinger et al. 2001

Diferències CD 28 humà-macac Residu 65 CD 28 Humà: Glicina (G) Macac: Àcid glutàmic (E) Hi ha alguna Lys, Arg o His en el TGN 1412 que pugui interaccionar amb el Glu de macacs i no amb la glicina d’humans? SI Activació més lenta de les cèl·lules T reguladores Les cèl·lules T secretores de citoquines romanen actives massa temps provocant la cascada de citoquines NO La interacció del TGN 1412 amb el CD 28 humà és menys eficaç que amb el CD 28 de macac degut a la pèrdua de la interacció electrostàtica

Avaluació del patró 84. 3% core 12% allow 1. 9% gener 1. 9 disall 76. 4% core RMS: 0. 17 ID seq: 96’ 58% 17% allow 3. 8% gener 2. 8 disall

Aa que interaccionen entre monòmers CD 28

Diferències seqüència CD 28 humà-macaca (aa 65)

CD 28 humà GLY 65

CD 28 macaca GLU 65 TGN 1412 GLU 65 TYR 30 CD 28

Interaccions CD 28 humà-TGN 1412

NAMD RMSD Distribució d’energia

Interaccions CD 28 humà-TGN 1412 Estructura 1: TGN 1412 Estructura 2: CD 28

Ponts d’hidrogen TGN 1412 GLU 32 HIS 98 TRP 32 SER 62 GLN 92 CD 28 LYS 63

Ponts d’hidrogen TYR 104 TGN 1412 TYR 99 GLU 97 CD 28 LYS 63 GLY 91

Interaccions hidrofòbiques NO HI HA INTERACCIÓ TGN 1412 CD 28

Interaccions electrostàtiques CD 28 GLU 32 HIS 98 TGN 1412

Interaccions CD 28 macaca-TGN 1412 Estructura 1: CD 28 Estructura 2: TGN 1412

Ponts d’hidrogen TYR 104 CD 28 TYR 99 GLU 97 GLU 32 TGN 1412 HIS 98

Interaccions hidrofòbique. S NO HI HA INTERACCIÓ TGN 1412 CD 28

Interaccions electrostàtiques TGN 1412 HIS 98 GLU 32 CD 28

Resum interaccions TGN 1412 -CD 28 humà i macaca Ponts d’Hidrogen Hidrofòbiques Electrostàtiques Entre CD 28 humà i macaca només hi ha HIS 98 -GLU 32 Coincidències TYR 99 -GLU 97 No diferència GLU 32 -HIS 98 tres ponts d’hidrogen de TYR 99 -TYR 104 Diferències en CD 28 humà TRP 32 -SER 62 GLN 92 -LYS 63 GLY 91 -LYS 63 - -

Procés incorrecte d’humanització

Procés incorrecte d’humanització Anticòs humanitzat: 5% ratolí 95% humà Anticòs humà al que se li han canviat els CDR pels de l’anticòs murí d’interès Fins quin punt està humanitzat? Analitzar el grau d’humanitat de la seqüència de l’anticòs humanitzat: 1. Comparar la seqüència amb una base de dades de seqüències de CDR i Fab humanes i amb una altra base de dades de ratolí 2. Analitzar, mitjançant els Z-scores, a quin dels dos s’assembla més

Comparació cadena lleugera

Comparació cadena pesada

Cadena pesada (TGN 1412/ratolí) Sc 9. 55 RMS 0. 38 % Id 73. 02

CDRs cadena pesada (TGN 1412/ratolí)

Cadena lleugera (TGN 1412/ratolí) Sc 8. 93 RMS 1. 16 % Id 75. 24

CDRs cadena lleugera (TGN 1412/ratolí)

Interaccions CD 28 humà-Ac murí CD 28 -LC Estructura 1: LC o HC Estructura 2: CD 28 -HC

Ponts d’hidrogen Els CDRs del TGN 1412 i de l’Ac murí són gairebé iguals interaccions amb CD 28 similars

TGN 1412 reconeix molècules amb domini Ig

Unió del TGN 1412 al CTLA-4 Tempesta de citoquines provocada pel TGN 1412: possible unió del TGN 1412 al receptor CTLA-4 provocant increment de la alliberació de citoquines • Elevada homologia estructural entre CD 28 i CTLA-4 • Bloqueig del receptor CTLA-4 per part del TGN 1412 L’arrest del cicle cel·lular en fase G 1 i el descens de la producció de citoquines impedits Increment de la proliferació de cèl·lules T

Homologia estructural CTLA-4 Sc 6. 10 RMS 1. 7 % Id 31. 52

Unió del TGN 1412 al CTLA-4 No es pot afirmar ni refutar perquè caldrien més aproximacions tan computacionals com experimentals.

Conclusió • La interacció de la cadena Fc del TGN 1412 pot ser reconeguda pel receptor Fc present en molts tipus de cèl·lules (com els mastòcits) desencadenant la tempesta de citoquines • Malgrat que CD 28 humà forma tres ponts d’hidrogen més amb TGN 1412 que les observades en el nostre model de macac no creiem que siguin prou diferents com per desencadenar respostes diferents • Els CDRs del TGN 1412 i de l'anticòs murí tot i tenir canvis de seqüència mantenen l’estructura idèntica per tant les seves interaccions amb el CD 28 seran similars • El receptor CTLA-4 per similud d’estructura amb CD 28 pot unir-se al TGN 1412 quedant bloquejades les funcions de les dues molècules

Bibliografia Evans EJ, Esnouf RM, et al. Crystal structure of a soluble CD 28 -Fab complex. Nat Immunol. 2005 Mar; 6(3): 231 -2 Schraven B, Kalinke U. CD 28 superagonists: what makes the difference in humans? Immunity. 2008 May; 28(5): 591 -5. Kenter MJ, Cohen AF. Establishing risk of human experimentation with drugs: lessons from TGN 1412. Lancet. 2006 Oct 14; 368(9544): 1387 -91. Alegre ML, Frauwirth KA, Thompson CB. T-cell regulation by CD 28 and CTLA-4. Nat Rev Immunol. 2001 Dec; 1(3): 220 -8. Carl Branden, John Tooze. Introduction to protein structure. 2 a ed. New York : Garland, cop. 1999

Preguntes PEM 1. Pel que fa a la superposició estructural de proteïnes: • L’estructura està més conservada que la seqüència • Els principals paràmetres per avaluar com de similars són dues estructures són: RMSD, Sc i Pij. • Les dues anteriors • STAMP és un programa que alinea basant-se en la seqüència primària • Cap de les anteriors 2. El TGN 1412: • És un anticòs policlonal humanitzat superagonista de CD 28 • Produeix l’activació dels limfòcits B • Inhibeix l’alliberament de citoquines • La regió Fc interacciona amb CD 28 • Cap de les anteriors 3. Pel que fa a les immunoglobulines: • El plegament és immunoglobulin-like beta-sandwich • Aquest domini està format per motius greek-key • L’orentació dels CDRs és rellevant per a la interacció • El domini constant té una estructura de dues fulles antiparal·leles que comprenen 7 cadenes β, 4 en una fulla i 3 en l’altra • Totes les anteriors són correctes

4. En relació a l’estructura de proteïnes: 5. • Les tècniques per determinar l’estructura terciària de la proteïna són: cristal·lografia de raigs X i RMN • Les forces no enllaçants que guien el plegament de les proteïnes són: interaccions electrostàtiques, forces de Van der Waals, ponts d’hidrogen i interaccions iòniques • Les dues anteriors son correctes • Amb la cristal·lografia de raigs X podem veure les proteïnes amb un elevat grau de detall atòmic • Totes les anteriors són correctes Importància de determinar l’estructura: • Hi ha un número limitat d’estructures • L’estructura no està tan conservada com la seqüència • Les dues anteriors són certes • L’estructura està més conservada que la seqüència • La a i la d són certes

6. Sobre el dicroisme circular: • És l'absorció diferencial entre llum perpendicularment polaritzada a un longitud d'ona determinada • Quan una substància té absorbància diferencial de la llum polaritzada de dretes i esquerres s'oberva el dicroisme circular • Les dues anteriors són certes • Els compostos especulars no tenen un espectre de dicrosime circular especular. • Totes són certes. 7. Respecte els infrarojos: • Correspon a la freqüència de vibració dels àtoms • Tenen el seu origen en les vibracions moleculars • Tenim dos tipus: de tensió i de deformació • Estan limitats en l'especte per els UV i el visible a) 1, 2 i 3 b) 1 i 3 c) 2 i 4 d) 4 e) 1, 2, 3 i 4

8. 9. De menys a més homologia quina classificació és la correcta: • Plegament Classe Superfamília Família • Família Superfamília Plegament Classe • Classe Plegament Superfamília Família • Classe Subclasse Plegament Família • Classe Família Superfamília Plegament Respecte el CD 28 d’humà i macaca i les seves interaccions: • El CD 28 no és una proteïna transmembrana. • Els ponts d’hidrogen es produeixen entre el parell d’electrons lliures de l’àtom acceptor i el protó del àtom donador. • L’epítop del superagonista es localitza en la hèlix que hi ha entre la cadena C’’ i D a l’extrem del domini V de tipus Ig. • Entre el receptor i l’anticós trobem moltes interaccions hidrofòbiques. • La posició 65 del receptor fa que la interacció de l’anticós sigui diferent entre humà i macaca.

10. Sobre l’humanització: • El procés d’humanització no afecta en absolut a la resposta HAMA. • Un anticòs humanitzat només té la Fc de ratolí substituïda per la d’humà. • Les dues anteriors són certes. • Per humanitzar l’anticòs cal substituir les CDR i comprovar que la interacció es manté. • Totes les anteriors són certes.