Anticuerpos irregulares clnicamente significativos y su deteccin pre

Anticuerpos irregulares clínicamente significativos y su detección pre transfusional Dra Fabiana Bastos División Inmunohematología Departamento de Hemoterapia e Inmunohematología Hospital de Clínicas “José de San Martín” Universidad de Buenos Aires cbastos@fmed. uba. ar

ANTICUERPOSc • REGULARES o ESPERADOS = • IRREGULARES o INESPERADOS

ANTICUERPOS • IRREGULARES o INESPERADOS – Aloanticuerpos INMUNES: en respuesta al estímulo con glóbulos rojos • Transfusión • Embarazo • Trasplante

ANTICUERPOS • IRREGULARES o INESPERADOS – Aloanticuerpos ocurrencia NATURAL: en respuesta a estímulos ambientales • Polen • Hongos • Bacterias

ORIGEN DE ANTICUERPOS INMUNES

Detección de anticuerpos irregulares • Juega un papel fundamental en la medicina Transfusional • Es un proceso clave en las pruebas de compatibilidad pre-transfusión • El objetivo de los métodos de detección es el hallazgo de los anticuerpos irregulares o inesperados • Presentes en 0. 2 - 2 % de la población general

ANTICUEPOS CLINICAMENTE SIGNIFICAIVOS • Capaces de iniciar la destrucción acelerada de los glóbulos rojos portadores del antígeno • ISBT >300 antígenos 30 sistemas de grupo sanguíneo • Especificidades asociadas con: – EHFN – RHPT – Acortamiento de la sobrevida de los GR transfundidos – AHAI

Destrucción de GR alogénicos transfundidos Reacción hemolítica postransfusional Destrucción de GR autólogos Anemia Hemolítica Autoinmune Destrucción de GR fetales Daño tejidos trasplantados Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal Rechazo del injerto

RHP Intravascular • Síntomas – Fiebre – Escalofríos – Shock – Hipotensión – Hemoglobinemia – Hemoglobinuria – IRA – CID

RHP Intravascular – Hemólisis rápida 10 min – Ig. M, fija C – 10% desenlace fatal • Anticuerpos implicados: – ABO – PP 1 PK – Vel – Lewis – Kidd

RHP Extravascular • Ig. G (Ig. G 1 o Ig. G 3) • Inmediata: durante o dentro de pocas horas: – Ac serológicamente detectable • Hiperbilirrubinemia • Anticuerpo implicados: – Kidd – Rh – Duffy

RHP Extravascular Tardía • • • Pacientes previamente inmunizados Ac presente Serológicamente indetectable Transfusión inicia respuesta anamnésica 5 -7 días postransfusión (2 -23 días) Fiebre, �Hto/Hb, ictericia, hemoglobinuria

Factores que determinan la importancia clínica Especificidad del anticuerpo. La concentración y la avidez de los anticuerpos. Rango térmico Clase y subclase de inmunoglobulina Actividad del sistema mononuclear fagocítico. Movilidad y densidad de sitios antigénicos en la membrana. • Volumen de glóbulos rojos administrados. • Presencia de sustancias solubles del grupo sanguíneo • • •

Factores que determinan la importancia clínica • Algunas especificidades tienen un comportamiento variable • No siempre podemos distinguir entre un Ac clínicamente significativo y uno benigno • No contamos con información inequívoca del comportamiento de algunos especificidades poco comunes • A veces no podemos precisar la especificidad de un Ac determinado

Importancia clínica Clínicamente significativos Significativos si reaccionan a 37ºC Significativos algunas veces Clínicamente benignos ABO Lea Yta Chido/Rodgers Rh M, N G JMH Kell P 1 Gya Knops Duffy Lutheran Hy Bg Kidd A 1 Ata Xg Ss. U Sda Colton Csa Vel An. Wj Cromer Yka PP 1 Pk Dombrock Mc. Ca H (Oh) Indian Jra Lan LW Scianna

Suelen producir RHPT Anticuerpos Comentarios ABO, H RTHI intravascular graves Rh(D, C, c, E, e) RTH inmediatas y retardadas K, k, Ku / resto RTH inmediatas / retardadas Fya, Fyb, Fy 3 RTH inmediatas y retardadas Jka, Jkb, Jk 3 RTH inmediatas y retardadas 1/3 de RTH retardadas son por anti-Jka S, s, U, Mur*, Mia*, Vw, Far, Ena RTH inmediatas y retardadas *Frecuentes en Sudeste Asiático Doa, Dob RTH inmediatas y retardadas P, PP 1 Pk (Tja) RTH inmediatas graves Vel RTH inmediatas graves An. Wja (CD 44) RTH inmediatas graves Wra RTH inmediatas graves Coa / Cob, Co 3 RTH retardadas / RTH leves Kx, Km RTH inmediatas graves

Raramente producen RHPT Anticuerpos Excepciones A 1, Lewis, P 1, LKE, I Suelen ser Ig. M no activos >25ºC P 1, A 1, Lea, Leb : RTH Inmediatas y Retardadas Lua, Lub Algunas RTHR moderadas Sistema Diego Wra es la excepción Yta, Scianna, LW, Ch/Rg, Ge, Cr, Kn, In, Yta, Tca(Cro 2), Inb, Lan, Ata, Jra: RTH Er, COST, Xga, MER 2, JMH, GIL, LKE, grave Sda, Lan, Ata, Jra, Emm 1 caso de RTHI por anti-JMH Oka, GIL, PEL, MAM No hay referencias, pero son potencialmente hemolíticos

Habitualmente producen EHFN Anticuerpos Comentarios Rh(D), c C, E, e, G Ce(f), Ce, Cw, Ew, Hro, Hr, Rh 29, , Go a, Rh 32, Bea, Evans, Tar, Sec, JAL, MAR-like EHRN grave y frecuente EHRN ocasional K K, Kpa, Jsb, Ula, Ku, K 22 Anemia aplásica > Anemia hemolítica EHRN leve ABO EHRN poco frecuente S, s, U M Ena, Mia, Vw, Mur, Hut, Hil, Mt a, Mv, Far, s. D, Or, Mut, Mur EHRN grave EHRN excepcionalmente grave EHRN ocasionalmente grave Fya, Fyb EHRN leve, grave. 1 caso por anti-Fyb Jka, Jkb No suelen producir EHRN. 1 caso grave Coa, Cob EHRN grave Dia, Dib, Wra, ELO, Bow Pocos casos. EHRN grave Ge Gralmente no causan EHRN 2 casos graves. Inhibe la eritopoyesis HJK, Kg, REIT, JVF, JONES, MAM Pocos casos. EHRN grave

Raramente producen EHFN Anticuerpos Comentarios Anti-PP 1 Pk (fenotipo p) Se asocian a abortos recurrentes 1 er trimestre. Lua, Lub Ags poco desarrollados en el feto. Acs adsorbidos por la placenta. Lea, Leb No activos a 37ºC. No se expresan en el feto. Acs de los sistemas: Yt, Do, LW, Ch/Rg, Cr, Kn, In Acs: Cost, Er, Sc 1, Sc 2, Sc 3, Xga, Oka, MER 2, JMH, GIL, Emm, An. Wj, Sda, Duclos, PEL, ABTI, HLA No se han descrito casos de EHRN grave. Vel Sólo formas leves. 1 caso por anti-Duclos. Ig. M. Poco expresado en el feto. Lan, Ata, Jra Sólo formas leves. 1 caso reciente grave por anti-Jra.

Anticuerpos poco comunes • • Conocer la etnia del paciente Conocer la historia clínica del paciente Conocer hallazgos serológicos previos Conocer medios óptimos de reacción, temperatura, etc

Especificidades relacionadas con la etnia • En un paciente de raza blanca, los Ac contra Ag de alta frecuencia se dirigen con mayor frecuencia contra: k, Kpb, Yta, Vel, Coa y Lub. • En individuos de raza negra los fenotipos S-s-UJs(b-) y hrs son exclusivos, y los fenotipos Fy(ab-), Le(a-b-), Cr(a-) y Lu(b-) son más comunes

Especificidades relacionadas con la etnia • El fenotipo In(b-) es exclusivo de la raza asiática, y los fenotipos Gy(a-), Jr(a-) y Di(a+b-) son mucho más frecuentes • En latinoamericanos: Di(a+b-), Ge: -2, 3 y Ge: -2, -3. • En el este de Europa es más común el fenotipo Gy(a-).

REACTIVOS GLOBULARES • Cada frasco contiene suspensión globular (0. 8 -6%) de un individuo • Deben estar tipificados al menos para los antígenos • D, C, E, c, e, P 1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S, s • Cada lote se manufactura con donantes diferentes • Cada lote se mantiene por 45 días

TECNICA • • • Colocar una gota de suspensión globular en un tubo Colocar dos gotas de suero en estudio Centrifugar y leer Incubar a 37ºC 30 minutos Centrifugar y leer Lavar tres veces con solución fisiológica Agregar dos gotas de suero de Coombs Centrifugar y leer En los negativos agregar Control Coombs

INTERPRETACION ¿En que fase ocurrió la reacción? ¿cuál es el resultado del control autólogo? ¿Cuántas células reaccionan? ¿Reaccionan con la misma fuerza y en la misma fase? • ¿Hay hemólisis o campo mixto? • ¿Están realmente aglutinados los GR o se debe a fenómeno de rouleaux? • •

INTERPRETACION • ¿En que fase ocurrió la reacción? – Ig. G reacciona mejor en fase antiglobulínica. Pueden ser aglutinantes a 37ºC. – Ig. M reacciona mejor a baja temperatura y es capaz de aglutinar GR suspendidos en solución fisiológica a temperatura ambiente. – Hay Ig. M que pueden reaccionar en SAGH debido a la fijación de complemento.

INTERPRETACION

INTERPRETACION • ¿Cuál es el resultado del control autólogo? – Se realiza enfrentando el suero del paciente con sus propios GR de la misma forma que se enfrenta a células del panel celular. – Control autólogo negativo en presencia de una detección de anticuerpos irregulares positiva indica la presencia de un Aloanticuerpo. – Control autólogo positivo indica la presencia de autoanticuerpos, anticuerpos inducidos por drogas.

INTERPRETACION • ¿Cuál es el resultado del control autólogo? – Si el paciente ha sido recientemente transfundido el control autólogo positivo puede deberse a la presencia de una aloanticuerpo unido a los GR transfundidos. – La evaluación de muestras control autólogo positivo o PCD positiva resulta en un problema complejo de resolver que necesita de la experiencia del operador. – El control autólogo puede omitirse durante la DAI pero debe realizarse en la identificación.

INTERPRETACION • ¿Cuántas células reaccionan? ¿Reaccionan con la misma fuerza y en la misma fase? – Presencia de un único anticuerpo dirigido contra un antígeno presente en ambas células del panel: • Todas las células reaccionan en la misma fase y con la misma intensidad – Presencia de múltiples anticuerpos. • Las células reaccionan con diferente intensidad o en diferentes medios – Presencia de autoanticuerpos. • Autocontrol positivo

INTERPRETACION • ¿Hay hemólisis o campo mixto? – Anti-Lea, anti-Leb, anti-Vel y anti-PP 1 Pk producen hemólisis in vitro – Anti-Sda, Lua y Lub producen reacciones en campo mixto.

INTERPRETACION • ¿Están realmente aglutinados los GR o se debe a fenómeno de rouleaux? – Se observa en todas las pruebas que contengan suero del paciente (autocontrol, inversa ABO) – Pacientes con relación albúmina-globulinas alterada (por ej. mieloma múltiple) – Pacientes que recibieron expansores plasmáticos (por ej. Dextran) – No interfiere con la fase aniglobulínica de las pruebas de detección e identificación de anticuerpos irregulares

EFECTO DOSIS Fya Fyb HETEROCIGOTA Fya HOMOCIGOTA El panel “ideal” tiene G. R. con expresión homocigota para la mayor cantidad de Ags posibles. (que expresen efecto de dosis). Si el resultado fuera anti-Fya

¿Qué antígenos del panel celular NO expresan EFECTO DE DOSIS con sus respectivos anticuerpos? I, i, Lea, Leb, P 1

LIMITACIONES • Relación suero-células – Exceso de anticuerpos – Exceso de antígenos – Puede aumentarse la relación a 4 gotas de suero para detectar anticuerpos débiles sin agregar potenciadores. • Temperatura • Tiempo de incubación • p. H

LIMITACIONES • Tiempo de incubación – Reacciones Ag-Ac están en equilibrio dinámico – El rango de tiempo es entre 30 -60 minutos para sistemas preparados en solución salina – Los medios potenciadores pueden disminuir este tiempo a 10 minutos

LIMITACIONES • p. H – Mayoría de los anticuerpos reaccionan entre 6. 8 y 7. 2 – Hay ejemplos de anti-M que reaccionan mejor a 6. 5

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Control antólogo • Exclusión • Inclusión • Tipificación GR del paciente • Calculo de error

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Exclusión – Excluir aquellas especificidades que no son responsables de la reactividad observada – Examinar las células con resultados negativos en todas las fases – Los antígenos presentes en las células que no reaccionaron no son el blanco del anticuerpo presente en el suero – EFECTO DE DOSIS

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Evaluar los resultados – Inclusión: evaluar los resultados obtenidos y comparar con la clave para cada especificidad • Tipificar GR del paciente – Debe estar ausente el antígeno hacia el cual está dirigido el/los anticuerpos. • Calculo de error

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Calculo de error

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Pensar en mas de una especificidad – La “clave”observada NO se ajusta a la de un sólo anticuerpo – Se observan reacciones de intensidad variable, que NO se explican por “efecto de dosis”. – Diferentes hematíes reaccionan en distintas fases – Al intentar confirmar la especificidad de un único Ac, se obtienen resultados inesperados.

lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AC D C E c e Cw K k Fya Fyb Jka Jkb P 1 Lea Leb M N S s T A 37 SA G ENZ + + o o + + o + o o o + + + o + O O + + o o + o + + + O O + o + + o o o O O 3+ 4+ o + + o o + + O O o o + + + o + + O O 1+ 4+ o o o + + o o o + + + O O o o o + + o o + o + + + O O + o o + o o + + O O o o o + + o + + o o o O O o o o + + o o + o + o o o + + O O o o o + + o + o + + O O

METODO para interpretar los resultados • CONTROL AUTOLOGO ? – NEGATIVO ALO ANTICUERPO • EXCLUSION – Qué Ag siguen implicados luego de la exclusión • TIPIFICACION GR PACIENTE – Ag ausente en membrana del GR • INCLUSION – La clave obtenida coincide con alguna prevista en el panel? • CONFIRMAR PROBABILIDAD DE ERROR

lote 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 AC D C E c e Cw K k Fya Fyb Jka Jkb P 1 Lea Leb M N S s T A 37 SA G ENZ + + o o + + o + o o o + + + o + O O + + o o + o + + + O O + o + + o o o O O 3+ 4+ o + + o o + + O O 2+ 4+ o o + + + o + + O O 2+ 4+ o o o + + o o o + + + O O 2+ 4+ o o o + + o o + o + + + O O 2+ 4+ + o o + o o + + O O 2+ 4+ o o o + + o + + o o o O O 2+ 4+ o o o + + o o + o + o o o + + O O 2+ 4+ o o o + + o + o + + O O 2+ 4+

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • NO excluidos –c –E – Lea • NO excluidos por heterocigota –M –S

METODO PARA INTERPRETAR RESULTADOS DE IDENTIFICACION • Inclusión: la clave obtenida coincide con alguna especificidad del panel? –c • Tipificación GR del paciente – R 1 R 1

TECNICA EN GEL

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TECNICA EN GEL Aglutinación Gel

Muchas Gracias