Anlisis molecular de la mutacin del EGFR en

Análisis molecular de la mutación del EGFR en el CPCNP: perspectiva del patólogo en el laboratorio de biología molecular Dra. Edith Illescas Patóloga y Directora del Laboratorio Oncogen S. R. L. Buenos Aires, Argentina

¿Cuándo debe analizarse el EGFR en el CPCNP? • Selección de pacientes para terapias TKI[a] • No deben ser excluidos pacientes basándonos en características clínicas: [b] – – Etnia Sexo Edad Historia del hábito de fumar CPNCP = cáncer de pulmón de células no pequeñas TKI = inhibidor de la tirosina quinasa a. Rosell R, et al. Lancet Oncol. 2012; 13: 239 -246. b. Zorrilla AF, et al. J Clin Oncol. 2012; 30(Suppl): Abstract e 18114.

¿Qué carcinomas deben analizarse? Recomendaciones del Colegio Americano de Patólogos y aplicación en Latinoamérica • Para carcinomas – Tipo histológico adenocarcinoma y carcinomas mixtos con componente de adenocarcinoma, sin tener en cuenta el grado histológico • No se recomienda en carcinomas de: – Células escamosas puras – Células pequeñas puras – Células grandes sin parámetros por inmunohistoquímica de evidencia de diferenciación adenocarcinomatosa College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

¿Qué carcinomas deben analizarse? (cont. ) Recomendaciones del Colegio Americano de Patólogos y aplicación en Latinoamérica • Se recomienda en los carcinomas realizar la determinación molecular independientemente del tipo histológico: – En muestras pequeñas (punción aguja fina – citológicos) – Cuando el componente adenocarcinomatoso no puede ser confirmado ni excluido – En tumores de tipo indiferenciados – Muestras de metástasis óseas que han sido descalcificadas o pretratadas con ácidos deben solo utilizarse para el análisis en caso de ser el único material biológico College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

¿Cuándo debe analizarse el paciente? • En el momento del diagnóstico, de la recurrencia o de la progresión • En pacientes en tratamiento de 1ª y/o 2ª línea • En tumores primarios – recurrencia y/o metástasis • En carcinomas en estadio avanzado (IV) • En estadios I, II y III, se tomará la decisión en colaboración interdisciplinaria con los médicos que lo están tratando College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

¿En qué tiempo deberá estar disponible el resultado? • En 5 a 7 días hábiles - comienzo del tratamiento en el momento adecuado • Dentro de las 48 h siguientes de la recepción de la muestra en el laboratorio, deberá confirmarse bajo control microscópico la viabilidad del análisis por metodología molecular College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

¿Qué muestras pueden estudiarse? TODAS • • Taco de parafina de resección quirúrgica Biopsia por punción Citológico Impronta Extendido Material fresco Material fijado en alcohol Hay que tener en cuenta que los requerimientos para inmunohistoquímicas y FISH (conservación proteica) no son necesarios para técnicas de ADN College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

¿Qué requerimientos son necesarios? • Viabilidad de la muestra • Microscopia óptica – – Presencia de células tumorales Calidad de células tumorales Cantidad de células tumorales (10%) Proporción de células tumorales • Selección de sectores tumorales bajo control microscópico de una tinción hematoxilina-eosina en la disección del corte en blanco, evitando tejido wildtype, si es posible College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

Envío incorrecto de la muestra Múltiples cortes de parafina Tumor quirúrgico Hay tumor ? ? ? Imagen cortesía del Laboratorio Oncogen S. R. L. Múltiples cortes de parafina Biopsia por punción Hay tumor? ? ?

Microdisección Corte en blanco Imagen cortesía del Laboratorio Oncogen S. R. L.

¿Qué metodologías de detección deben utilizarse? Metodologías que detecten un mínimo del 10% de células tumorales y el 99, 9% de las alteraciones génicas posibles • Sistema de PCR de los exones 18, 19, 20 y 21 Sistema nested o heminested (recomendable en material parafinado) Recomendación técnicas por PCR nested y secuenciación automática College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

¿Cómo debe entregarse el resultado? • Con la alteración génica encontrada, indicar la inserción, mutación, deleción, el codón y el aminoácido • Incluir la interpretación adecuada concreta y completa del tipo de alteración y su implicancia en el tratamiento con TKI • Alteración clásica o no clásica • Entrega de los informes de secuenciación bidireccionales con el primer FW y RV de cada exón descartando falsos positivos o secuencias artificiales por degradación del ADN o mal procesamiento preanalítico College of American Pathologists http: //www. cap. org/apps/cap. portal

Ejemplo del exón 19 G 729 acgtcttctctctctgtcatag gga I 732 att P 733 cca E 734 gaa G 735 ggt E 736 gag K 737 aaa V 738 gtt K 739 aaa V 742 gtc A 743 gct I 744 atc K 745 aag E 746 gaa L 747 tta R 748 aga E 749 gaa A 750 gca T 751 aca S 752 tct P 753 ccg K 754 aaa A 755 gcc N 756 aac K 757 aag E 758 gaa I 759 atc L 760 ctc D 761 gat 762 gtg 763 agt 764 ttc tttgctgtgtgggggtccatggctctgaacctcaggcccaccttttct Laboratorio Oncogen S. R. L. L 730 ctc W 731 tgg I 740 att P 741 ccc 765 tgc

Exón 20 EGFR - R 803 W – CGG-TGG Arginina-triptófano T Arginina-triptofano Imagen cortesía del Laboratorio Oncogen S. R. L. R 803 W CGG-TGG

La mutación como paradigma en el análisis del EGFR en el CPCNP Es estudiar a todo paciente sin excluirlos basándose en características clínicas como: • • Etnia Sexo Edad Historia del hábito de fumar Zorrilla AF, et al. J Clin Oncol. 2012; 30(Suppl): Abstract e 18114.

Gracias por su participación en esta actividad.