Anlise Instrumental Tcnicas de Separao CAL 410012 Profa

Análise Instrumental Técnicas de Separação CAL 410012 Profa. Ana Carolina Costa ana. costa@ufsc. br Introdução às separações HPLC

Conceitos • A FASE ESTACIONÁRIA em cromatografia é imobilizada em uma coluna ou sobre uma superfície plana. • A FASE MÓVEL em cromatografia movimenta-se através da fase estacionária transportando a mistura dos analitos. A fase móvel pode ser um gás, um líquido ou um fluido supercrítico. • A ELUIÇÃO é um processo no qual os solutos são levados através da fase estacionária pelo movimento de uma fase móvel. A fase móvel que deixa a coluna é denominada eluato. • Um ELUENTE é um solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através de uma fase estacionária. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos (a) Diagrama descrevendo a separação de uma mistura dos componentes A e B por eluição em cromatografia em coluna. (b) O sinal do detector em vários estágios da eluição mostrados em (a) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos Perfis de concentração dos solutos A e B na coluna no t 1 e mais tarde no t 2 B é mais fortemente retido pela fase estacionária do que A, portanto B se atrasa durante a migração. A distância aumenta a medida que os dois se movem pela coluna. Alargamento das bandas = perda de eficiência Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos Muitas variáveis físicas e químicas influenciam as velocidades das bandas e seu alargamento. Como consequência, melhores separações podem ser geralmente obtidas pelo controle de variáveis que aumentam a velocidade de separação das bandas ou diminuem a velocidade de alargamento delas. Cromatograma original com picos sobrepostos Melhoria proporcionada pelo aumento da separação das bandas Melhoria proporcionada pela diminuição das larguras Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos A extensão do alargamento de uma banda depende do tempo que a FM fica em contato com a FE, o qual por sua vez depende da vazão da FM. • VOLUME DE RETENÇÃO (VR) é o volume da fase móvel necessário para eluir o analito a uma dada vazão (F). Volume de retenção, VR = t. R F • VOLUME MORTO (VM) é o volume total de solvente na coluna entre as partículas da fase estacionária (partículas não porosas) e no interior dos poros das partículas (partículas porosas, tipo esponja). Portanto, se o tempo para que a fase móvel ou o soluto não retido passe pela coluna é t. M, e a vazão é F: V M = t. M F Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos § FATOR DE RETENÇÃO*: o fator de retenção (k) é o grau de retenção de um componente da amostra na coluna, sendo definido como o tempo necessário para eluir o pico (t. R) menos o tempo necessário para a FM passar através da coluna (t. M). k= *Fator de capacidade em algumas referências. t. R – t. M t‘R = t M t. M Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Fator de retenção • Um pico com k = zero, indica um componente não retido pela FE e eluído com o solvente. Portanto, quando k é 1, separação ruim, t. R t. M. • Quando k é > 20 ou 30, a separação é lenta, indica que o soluto está altamente retido, apresentando tempos de eluição muito longos. Sendo de difícil detecção, uma vez que apresentam alargamento das bandas. • Na maioria das análises, os compostos eluem com k entre 1 e 20, então esses possuem “oportunidade suficiente” para interagir com a FE, resultando em uma migração diferenciada. • Separação ideal: k entre 1 e 5. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Constante de distribuição • A eficiência de uma coluna cromatográfica em separar dois solutos depende em parte das velocidades relativas segundo as quais as duas espécies são eluídas. Essas velocidades, por sua vez, são determinadas pelas razões das concentrações dos solutos em cada uma das fases. • Todas as separações cromatográficas estão baseadas em diferenças de extensão na qual os solutos são distribuídos entre as fases móvel e estacionária. Para o soluto de espécie A, o equilíbrio envolvido é descrito pela equação A (móvel) A (estacionária) • A constante de equilíbrio K para essa reação é denominada constante de distribuição, a qual é definida como: [A]E K= [A] M Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Constante de distribuição • Então, a distribuição do analito A é governada pela constante de distribuição (também chamada de coeficiente de partição), K. • O fator de retenção (k) também pode ser descrito pela razão do número total de mols do analito em cada fase: k= mols do soluto A na FE mols do soluto A na FM [A]E VE [A]E , sendo k= K = [A]M VM [A]M então, k = K VE VM • Onde VE é o volume da fase estacionária e VM é o volume da fase móvel na coluna ou o volume morto. k é primariamente controlado pela força da fase móvel, a natureza da fase estacionária, e a temperatura em que a Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fatores que influenciam a retenção de um soluto ü A separação é efetuada tendo por base a afinidade química relativa de cada componente da amostra pelas fases móvel e estacionária. ü Este parâmetro depende de: ü Tipo e propriedades da fase estacionária ü Tipo e propriedades da fase móvel ü Forças intermoleculares: ü Analito e fase móvel ü Analito e fase estacionária ü Temperatura • Forças de dispersão de London (interações dipolo induzido – dipolo induzido) • Interações dipolo – dipolo induzido • Interações iônicas • Pontes de hidrogênio Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Fator de separação (seletividade) • O fator de seletividade (ou fator de separação) para os solutos 1 e 2 é definido como a razão entre a constante de distribuição do soluto mais retido (2) e a constante de distribuição para o soluto menos retido (1). • A seletividade deve ser > 1, 0 para que haja a separação dos picos. • Seletividade é dependente de muitos fatores que afetam K tal como a natureza da FE, composição da FM, e propriedades dos solutos. K, constante de distribuição; k = fator de retenção Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Exercícios: 1) Em uma análise cromatográfica de ácido de baixo peso molecular, o ácido butírico elui com um tempo de retenção (t. R) de 7, 63 min. O tempo de retenção da fase móvel (t. M) é 0, 31 min. Calcule o fator de retenção (k) do ácido butírico. (23, 6) 2) Na mesma análise cromatográfica para ácidos de baixo peso molecular do exemplo anterior, o tempo de retenção para o ácido isobutírico é 5, 98 min. Qual o fator de separação (α) para o ácido butírico e isobutírico? (1, 29) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Resolução • A resolução Rs de uma coluna nos diz o quanto duas bandas se distanciam uma em relação a outra em comparação com as suas larguras. • A resolução fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar dois analitos. Rs = 2 (t. R)2–(t. R)1 w 1 + w 2 Rs = (t. R)2–(t. R)1 (w 1 + w 2)/2 Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Resolução Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Resolução Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

m Exercício 3) s. Um pico vizinho é eluído a 424 s com uma largura de 16 s. Encontre a resolução entre esses dois componentes. (1, 17) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Descrição quantitativa da eficiência da coluna TEORIA DOS PRATOS MARTIN e SYNGE: em 1920 estabeleceram analogias entre a cromatografia, a destilação e a extração com solventes; • Consideraram que uma coluna cromatográfica consistia de vários estágios de extração líquido-líquido, ou pratos teóricos (termo emprestado da teoria da destilação, técnica popular na época) sendo conhecido como teoria dos pratos. PRÊMIO NOBEL em 1952 Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Descrição quantitativa da eficiência da coluna TEORIA DOS PRATOS Entretanto, uma coluna cromatográfica não possui os pratos como na destilação, mas a fase estacionária é distribuída uniformemente, de maneira que vários estágios de equilíbrio entre a FE e a FM irão ocorrer. Pela inexistência de pratos reais como em destilação, estes pratos foram denominados de pratos teóricos. Contudo, o modelo de pratos não é bem sucedido ao tentar explicar o alargamento das bandas, mas serve para explicar o formato gaussiano dos picos cromatográficos, bem como os fatores que influenciam as nas velocidades de migração dos solutos. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Descrição quantitativa da eficiência da coluna Dois termos relacionados são empregados amplamente para as medidas quantitativas da eficiência da coluna cromatográfica • Altura de prato H • Contagem de pratos ou número de pratos teóricos N L As duas estão relacionadas pela equação: H ou HETP = N em que L é o comprimento (geralmente em cm) do recheio da coluna. A eficiência cromatográfica aumenta à medida que o número de pratos se torna maior, e, conforme a altura do prato H torna -se menor. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Altura equivalente a um prato H ou HETP= L N • A altura do prato, H, foi adaptado da teoria da destilação (já discutido anteriormente) , onde a separação pode ser feita em estágios discretos denominados pratos. A altura do prato também é conhecida como altura equivalente a um prato teórico (HETP ou H). Ela é, aproximadamente, o comprimento da coluna necessário para que o soluto atinja um equilíbrio entre as fases móvel e estacionária. • Quanto menor a altura do prato, menor a altura do prato menor a largura da banda • A capacidade de uma coluna em separar os componentes de uma mistura aumenta com a diminuição da altura do prato. • Dizemos que uma coluna eficiente tem mais pratos teóricos do que uma coluna ineficiente. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Altura equivalente a um prato • Solutos diferentes, passando através da mesma coluna, possuem alturas de pratos diferentes, pois possuem coeficientes de difusão diferentes. • Curiosidade: as alturas dos pratos se situam na faixa de 0, 1 a 1 mm na CG, 10 µm na HPLC e < 1 µm na EC. H= L N Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Altura equivalente a um prato • Uma vez que o modelo de pratos não constitui uma representação muito boa de uma coluna cromatográfica, alguns autores sugerem que se evite atribuir qualquer significado aos termos prato e altura de prato e, veja esses termos como designadores de eficiência da coluna que são mantidos por razões históricas somente, e não porque apresentem qualquer significado físico. • Esses termos estão bem estabelecidos na literatura cromatográfica que a substituição por designações mais apropriadas parece improvável (pelo menos num futuro próximo) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Descrição quantitativa da eficiência da coluna O número de pratos teóricos, N, e a altura de prato, H, são amplamente utilizados na literatura pelos fabricantes de instrumentos como uma medida do desempenho da coluna. N pode ser determinado a partir de um cromatograma, pelo conhecimento de t. R e Wb ou W 1/2 t N = 16 R wb 2 t N = 5, 546 R W½ 2 Para picos mal resolvidos Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Descrição quantitativa da eficiência da coluna t. R = 1, 67 min Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Conceitos – Número de pratos Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Eficiência da coluna VARIÁVEIS CINÉTICAS QUE AFETAM A EFICIÊNCIA DA COLUNA O alargamento da banda reflete-se em uma perda da eficiência da coluna. Quanto mais lentas forem as velocidades dos processos de transferência de massa que ocorrem durante a migração do soluto através da coluna, maior será o alargamento da banda na saída da coluna. Algumas variáveis que afetam as velocidades de transferência de massa podem ser controladas e exploradas para melhorar as separações. Algumas variáveis importantes: Variável Símbolo Unidades usuais u cm s-1 DM** cm 2 s-1 Coeficiente de difusão na fase estacionária* DS cm 2 s-1 Fator de retenção (ver Eq. ) k adimensional Diâmetro das partículas do recheio dp cm Espessura do filme líquido que recobre o suporte df cm Velocidade linear da FM Coeficiente de difusão na fase móvel* *Aumenta com o aumento da temperatura e com a diminuição da viscosidade. **Em líquidos, os valores de DM, para moléculas de tamanho pequeno e médio são da ordem de 10 -5 cm 2 s-1; em gases, os valores de DM são 105 vezes maiores

Eficiência cromatográfica Equação de van Deemter (1950) A Equação, denominada equação de van Deemter, foi desenvolvida por engenheiros químicos da Holanda, em 1950, e é muito usada para descrever a eficiência de uma coluna cromatográfica H = A + B/u + (CE + CM) u Onde H é a altura de prato em centímetros e u é a velocidade linear da fase móvel em centímetros por segundos. O termo A é um coeficiente que descreve os efeitos dos caminhos múltiplos (difusão tubilhonar ou turbulenta); B é o coeficiente de difusão longitudinal; e CE e CM são os coeficientes de transferência de massa para as fases estacionária e móvel, respectivamente. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Eficiência cromatográfica DIFUSÃO LONGITUDINAL termo B CAMINHOS MÚLTIPLOS termo A H = A + B/u + (CE + CM) u TRANSFERÊNCIA DE MASSA NA FASE ESTACIONÁRIA termo Cs TRANSFERÊNCIA DE MASSA NA FASE MÓVEL termo Cm Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

EQUAÇÃO de van DEEMTER A = 2 l d. P o termo A (caminhos múltiplos) diâmetro da partícula o caminhos múltiplos de fluxo Uma vez que diferentes moléculas do mesmo soluto tomam diferentes caminhos, elas chegarão ao final do leito em diferentes tempos, e a zona como um todo vai se alargar. Por que o leito cromatográfico apresenta caminhos irregulares. Detector Sinal detectado l: constante que depende da qualidade do enchimento da coluna Tempo Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

EQUAÇÃO de van DEEMTER B/u = (2 DM) / u o termo B/u (difusão longitudinal) • a grandeza do termo B é predominantemente determinada pelo coeficiente de difusão DM do analito na fase móvel e é diretamente proporcional a essa constante. • as moléculas da amostra irão difundir de uma região de maior concentração (banda inicial ou centro da zona) para uma região de concentração menor. • contribuição da difusão longitudinal é inversamente proporcional à velocidade da fase móvel: com o aumento de u, soluto permanece na coluna por períodos mais curtos (difusão tem menos tempo para ocorrer). DM: coeficiente de difusão do soluto na FM : constante que depende da qualidade do enchimento da coluna Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

EQUAÇÃO de van DEEMTER o termo C (coeficientes de transferência de massa na FM) CM u = (f(k) dp 2 / DM) u • ao passar no interstício de partículas, as moléculas que viajam perto das paredes da fase estacionária terão velocidades menores daquelas que viajam no centro. • a velocidade da fase móvel aumenta o valor de H, porém, o diâmetro da partícula contribui ainda mais por estar ao quadrado. o termo C (coeficientes de transferência de massa na FE) CE u = (f(k) df 2 / DE) u • após a difusão das moléculas dentro do poro, elas penetram na FE ou se ligam a ela por algum mecanismo. Se algumas penetram mais profundamente dentro da FE, também demorarão mais a sair e consequentemente se atrasarão em relação a outras e como consequência o pico se alargará.

EQUAÇÃO de van DEEMTER H, cm dependem da qualidade do recheio DS, DM: coeficientes de difusão do soluto na fase estacionária e móvel, respectivamente 0, 0060 H = A + B/u + (CE + CM) u 0, 0040 H CE u 0, 0020 l, : constantes que CM u dp, df: diâmetro da partícula e espessura do filme que recobre o suporte da fase estacionária Contribuição dos vários termos de transferência de massa para a altura do prato. B/u 0 0 0, 1 0, 2 0, 3 0, 4 0, 5 u, cm/s (velocidade da fase móvel) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

High Performance Liquid Chromatography Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Cromatografia a líquido Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

HPLC “HPLC usa pressões elevadas para forçar a passagem do solvente através de colunas fechadas que contém partículas muito finas capazes de proporcionar separações muito eficientes (com alta resolução)”. Daniel C. Harris. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia líquida de alta eficiência Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação reservatório da fase móvel e sistemas de tratamento de solvente • Recipientes contendo fase móvel que será bombeada dentro do sistema analítico. Características desejadas para reservatórios de FM são: • Reservatórios com capacidade de 1 a 2 L, vidro (borossilicato) ou dependendo da FM – outro polímero conveniente ou teflon; • Sua tampa deve conter furos para a passagem de tubulações, as quais servirão de canal de passagem de fase móvel (linha de solvente). A superfície livre dos furos deve ser a menor possível a fim de evitar a difusão de solvente para a atmosfera; • É comum proceder-se a desgaseificação da FM, com a intenção de eliminar gases nela dissolvidos que poderão, principalmente na bomba, criar bolhas, causando aumento do ruído da linha de base; • A linha de solvente deve possuir obrigatoriamente um filtro para reter partículas sólidas porventura existente – vidro sinterizado. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação reservatório da fase móvel e sistemas de tratamento de solvente • Equipados com dispositivo para remoção de gases dissolvidos (evitar formação de bolhas: causam alargamento ou interferem na eficiência do detector) • Desgaseificadores: bomba de vácuo dispositivos para aquecimento e agitação do solvente borbulhamento de gases inertes (He ou N 2) junto com agitação • Câmara de mistura: eluições em gradiente • Solventes misturados à soluções tampão altas concentrações de ácidos orgânicos e sais devem ser evitadas corrosão da bomba e outras partes do equipamento; precipitação de sais, etc. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação sistemas de bombeamento REQUISITOS: • pressões de até 10 000 psi ( 690 bars) • a maioria das partes de uma bomba de LC que entram em contato com a FM são construídas de aço inoxidável • vazão contínua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos) • vazões de 0, 01 a 10 m. L/min (aplicações analíticas) e até 100 m. L/min (aplicações preparativas) • devem ser capazes de pressurizar os solventes com precisão e exatidão (melhor que 0, 5 %) • devem ser compatíveis com ampla faixa de fluxo do solvente, fáceis de trocar de solvente, e atender aos gradientes de eluição 2 TIPOS: • bombas de pressão (ou pneumáticas) recheio de colunas (gera elevadas pressões) • bombas mecânicas: recíprocas mais utilizadas (equipamentos comerciais) deslocamento (tipo seringa) reservatório da FM Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação bombas recíprocas coluna motor vedação pistão recíproco amortecedor de pulso válvulas de controle do tipo bola solvente DESVANTAGENS: • fluxo pulsado que deve ser amortecido (ruído de fundo na linha de base) • 2 válvulas (esferas de safira) são abertas e fechadas alternadamente para controlar a vazão de solvente dentro e fora do cilindro; solvente está em contato direto com o pistão VANTAGENS: • pequeno volume interno (35 a 400 m. L) • pressões elevadas de saída (até 10000 psi) • fácil adaptação a eluição em gradiente • vazão constante • fluxo independe da pressão de retorno da coluna e da viscosidade do solvente Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação tipos de eluição • Isocrática: A composição da fase móvel (%) permanece constante durante toda a análise cromatográfica. É realizada com um único solvente ou mistura constante de solventes. • Gradiente: Ocorre alterações da composição da fase móvel (%) durante a execução da análise. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação sistema de injeção de amostras Válvula de injeção para HPLC com alça de amostragem substituível em vários tamanhos de volume fixo • fator limitante da precisão: repetibilidade da injeção • volumes devem ser pequenos (evitar alargamento de banda e sobrecarga da coluna, “overload”): < 500 µL • Conveniente injetar amostra sem despressurizar o sistema • sistema mais comum: alça de injeção (loop) mediante seringa; escolha de 0, 5 a 500 µL; permite injeção a pressões de até 7000 psi; precisão melhor que 1% Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação sistema de injeção das amostras Bomba Coluna Loop Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação colunas • em geral, tubos de aço inoxidável, mas tubos de vidro com paredes resistentes também são encontrados (restritos a pressões mais baixas, 600 psi) • diversidade de colunas recheadas são disponíveis comercialmente, com preços a partir de US$ 500 (colunas quirais > US$ 1000) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação colunas Descrição Polaridade/ interação Octadecil (C 18) Altamente apolar Octil (C 8) Moderadamente apolar Etil (C 2) Fracamente apolar Metil (C 1) Fracamente apolar Fenil (PH) Moderadamente apolar Cicloexano (CH) Moderadamente apolar Cianopropil (CN) Moderadamente apolar/polar Diol ( 2 OH) Polar Sílica (Si) Polar Ácido Carboxílico (CBA) Troca catiônica fraca Ácido Propilsulfônico (PRS) Troca catiônica forte Ácido Benzenossulfônico (SCX) Troca catiônica forte Aminopropil (NH 2) Troca aniônica fraca/polar Amina Primária/Secundária (PSA) Troca aniônica fraca/polar Dietilaminopropil (DEA) Troca aniônica fraca/polar Amina Quaternária (SAX) Troca aniônica forte Ácido Fenilborônico (PBA) Covalente Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação colunas • Colunas analíticas: em geral de 10 a 30 cm; 4 a 10 mm diâmetro com partículas de 1, 8, 3, 5 e 10 mm (60 000 pratos/m) • Colunas de guarda ( de pré-coluna): introduzida antes da coluna de separação para aumentar a vida útil desta remove material particulado e contaminantes provenientes do solvente (que se ligam irreversivelmente a FE) serve para saturar a fase móvel com fase estacionária minimizando a sangria da coluna composição deve ser similar a da coluna analítica, com tamanho de partícula em geral maior (minimizar queda de pressão) • Termostatização: em geral coluna é operada a temperatura ambiente; no entanto, cromatogramas de melhor qualidade são obtidos quando a temperatura da coluna é controlada; fornos aquecidos até 150 C estão disponíveis Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação características de um detector Monitoramento do eluente que sai da coluna ESTRATÉGIAS: • medidas diferenciadas de propriedades gerais de ambas, amostras e fase móvel • medidas de uma propriedade da amostra que não é apresentada pela fase móvel Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação características de um detector ü Detectabilidade adequada: nem sempre é desejável, deve ser compatível com a concentração do analito na amostra ü Resposta linear para os solutos que se estenda por várias ordens de grandeza: faixa linear é aquela região da curva de calibração que se ajusta bem a uma reta ü Baixo volume interno: grande volume pode gerar alargamento das bandas geradas ü Tempo de resposta curto: detectores com respostas lentas geram bandas deformadas (baixa e larga) e com cauda longa. ü Boa estabilidade e reprodutibilidade: aumenta a confiabilidade nos resultados. ü Não deve ser destrutivo: permite coletar frações e utilizar detectores em linha. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação tipos de detectores 2 TIPOS BASICAMENTE: SELETIVO versus UNIVERSAL Os detectores em cromatografia líquida são de 2 tipos: DETECTORES DE PROPRIEDADES UNIVERSAIS: respondem às propriedades da fase móvel como um todo, como índice de refração, constante dielétrica ou densidade, a qual é modulada pela presença do soluto. DETECTORES DE PROPRIEDADE DO SOLUTO ou SELETIVOS: respondem a algumas propriedades do soluto (absorvância no UV-vis, fluorescência ou corrente de difusão, que não incluem a fase móvel. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação parâmetros de desempenho • sensibilidade: relação entre o sinal produzido e a quantidade de amostra que gera este sinal (termo relativo, depende da amostra) • linearidade: faixa linear do sistema onde o sinal do detector é diretamente proporcional à concentração do soluto; se concentração da amostra é muito alta (diluições apropriadas) • limite mínimo de detecção: menor quantidade da substância que pode ser detectada, produzindo um sinal igual ao triplo do nível de ruído do instrumento; ruído é a variação do sinal do instrumento que não é atribuída à amostra e pode ser produzida por falhas eletrônicas, aparelhos mal aterrados, variações de vazão ou temperatura, flutuações na tensão, bolhas de ar no detector, componentes da matriz, etc. • variações na composição da fase móvel podem produzir grandes flutuações na linha de base, principalmente nos casos de eluição por gradiente Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação detectores de absorvância PRINCÍPIO: absorvância da luz por parte da amostra ao passar através desta qualquer radiação eletromagnética (normalmente do ultravileta até o infravermelho) • resposta seletiva: só detecta os componentes da amostra que absorvem a radiação no comprimento de onda selecionado; grande maioria das substâncias absorvem radiação UV (substâncias com elétrons ou elétrons desemparelhados), por exemplo: Olefinas ( hidrocarboneto alifático, ou seja, de cadeia aberta, apresentando pelo menos uma ligação dupla entre os carbonos – alcenos), compostos aromáticos e compostos contendo >C=O, >C=S, -N=O e –N=N- Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação detectores de absorvância da coluna janelas de quartzo UV detector • volume é mantido pequeno para minimizar alargamento de banda: 1 -10 m. L • comprimento: 2 -10 mm • P < 600 psi (redutor de pressão é requerido descarte Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Instrumentação detectores de absorvância Detectores mais utilizados em HPLC Detector Ultravioleta Índice de refração Espalhamento de luz Eletroquímico Fluorescência Espectrometria de massas Infravermelho com transformada de Fourier Limite de detecção (ng) Gradiente Aplicação 0, 1 -1 100 -1000 0, 1 -1 Sim Não Sim 0, 01 -1 0, 0001 -0, 01 0, 1 -1 1000 Não Sim Sim Seletivo Universal Alta massa molar Seletivo Universal Seletivo Fonte: VOGEL, 2002; HARRIS, 2005. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel características desejáveis üalto grau de pureza ou de fácil purificação (permitir alta sensibilidade nos detectores de absorvância ou fluorescência) üdissolver a amostra sem decompor os seus componentes (se possível, solvente da amostra é a própria fase móvel) ünão decompor ou dissolver a fase estacionária (uso da précoluna para saturação da fase móvel com fase estacionária; fase ligada ou sólida dispensam esse procedimento) üter baixa viscosidade (favorecer transferência de massa) üser compatível com o tipo de detector utilizado (particularmente importante na eluição por gradiente) üter polaridade adequada para permitir separação conveniente dos componentes da amostra Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel SOLVENTE ÍNDICE DE REFRAÇÃO n-Hexano 1, . 372 CCL 4 1, 457 Éter dietílico 1, 350 THF 1, 405 Clorofórmio 1, 433 Etanol 1, 359 características desejáveis VISCOSIDADE PONTO DE c. P EBULIÇÃO C ÍNDICE DE POLARIDADE FORÇA DO ELUENTE* 0, 30 81 0, 04 -0, 2 0, 46 66 4, 0 0, 57 Acetato de etila 1, 370 Me. OH 1, 326 0, 54 65 5, 1 0, 95 ACN 1, 341 0, 34 82 5, 8 0, 65 Etileno glicol 1, 431 Água 1, 333 0, 89 100 10, 2 grande *sobre Al 2 O 3

Cromatografia por partição Tipo mais utilizado de cromatografia, na qual a FE é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da FM. • Líquido-líquido: o líquido estacionário é mantido por adsorção física. • Fase ligada: o líquido estacionário encontra-se quimicamente ligado, resultando em recheios altamente estáveis, insolúveis na FM – compatíveis com as técnicas de eluição por gradiente. • Mais de 90% das análises atuais são realizadas com fase ligada. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição Fase ligada A superfície da sílica completamente hidrolisada (por aquecimento com HCl 0, 1 mol L 1 por um ou dois dias) é constituída de grupos silanóis quimicamente reativos. Si-OH + R 3 Si. Cl Si-O-Si-(CH 3)2 R + HCl Os recobrimentos com fase ligada mais empregados são os siloxanos formados pela reação da superfície hidrolisada da sílica com um organoclorossilano. Ciano (-C 2 H 4 CN) • • OH Si silanol livre R= Diol (-C 3 H 6 OCH 2 CHOHCH 2 OH) Amina (–C 3 H 6 NH 2) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição fase normal x fase reversa • Fase normal: – fase estacionária polar; – fase móvel menos polar que a FE (n-alcanos, clorofórmio, acetato de etila); – solutos neutros; – polaridade soluto t. retenção; – mecanismo retenção: adsorção. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Polaridade da fase móvel Cromatografia de partição Polaridade do soluto: a > b > c c b a tempo c b a Fase normal • Nos trabalhos pioneiros usouse fases altamente polares, como trietilenoglicol adsorvidos sobre sílica ou alumina e solventes apolares, como hexano ou éter isopropílico, eram usados como fase móvel; por razões históricas, este tipo de cromatografia é chamado de fase normal tempo • Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando a polaridade da fase móvel tem o efeito de diminuir o tempo de eluição. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição Fase normal Partícula de sílica – partículas uniformes, porosas, mecanicamente rígidas, tendo comumente diâmetros de 3 a 5 µm. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição fase normal x fase reversa • Fase reversa: – fase estacionária apolar (geralmente um HC); – fase móvel é um solvente relativamente polar (tampões, água, metanol, acetonitrila, THF); – solutos apolares, não-iônicos; – polaridade f. móvel t. retenção; – mecanismo retenção: interações apolares com radicais da coluna. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição fase reversa Polaridade da fase móvel Polaridade do soluto: a > b > c a b c tempo a b • Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionária é apolar, um hidrocarboneto por exemplo (C 18) e a fase móvel é relativamente polar (água, metanol, acetonitrila, etc) c tempo • Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase móvel; aumentando-se a polaridade da fase móvel aumenta-se o tempo de eluição Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição fase reversa • Fase ligada Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição fase reversa • Fase ligada Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição Si-OH + R 3 Si. Cl fase reversa Si-O-Si-R 3 + HCl partição (solubilização) Si. R 2 O Si-O-Si. R 2 cadeias do hidrocarboneto (C 18) soluto Obs. nas fases ligadas, tem-se também a possibilidade de adsorção do soluto devido aos sítios ativos (silanóis residuais) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia de partição fase reversa n. A sílica tem aproximadamente 8 M de grupos Si-OH por m 2. A cobertura superficial por silanização esta limitada a 4 M devido a efeitos estéricos. Os Si-OH restantes são prejudiciais causando alargamento das bandas devido a polarização da superfície. Principalmente na análise de analitos básicos. Reação com trimetilsilano (efeito estérico reduzido -CH 3) minimiza o problema (encapados) Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel tipos de eluição • Isocrática: A composição da fase móvel (%) permanece constante durante toda a análise cromatográfica. É realizada com um único solvente ou mistura constante de solventes. • Gradiente: Ocorre alterações da composição da fase móvel (%) durante a execução da análise. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel tipos de eluição A eluição isocrática é feita com um único solvente (ou mistura de solventes). Se um solvente não propiciar uma eluição suficientemente rápida de todos os componentes, então pode ser utilizada uma eluição por gradiente. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel tipos de eluição • Separação isocrática por HPLC de uma mistura de compostos aromáticos a 1 m. L/min em uma coluna C 18. Solvente A: água; solvente B: acetonitrila (p. H 3, 5 aj. com KH 2 PO 4) 1) Álcool benzílico 2) Fenol 3) 3’-4’-dimetoxia cetofenona 4) benzoína 5) Benzoato de etila 6) Tolueno 7) 2, 6 -dimetoxi tolueno 8) ortometoxi bifenila Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel ISOCRÁTICO f orça Compostos eluídos + rápidos Em uma separação em fase reversa, a força do eluente diminui quando o solvente se torna mais polar. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel ISOCRÁTICO Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel ISOCRÁTICO duas horas de corrida cromatográfica Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel tipos de eluição Com base nas eluições isocráticas foi elaborado o gradiente a seguir. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel GRADIENTE Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Fase móvel tipos de eluição Pode haver várias formas de se separar um dado conjunto de analitos, entretanto algumas informações são essenciais para determinação do modo de operação Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LÍQUIDO • espécies MM>104: cromatografia por exclusão insolúvel em água não-polar iônico polar não-iônico 102 massa molecular • espécies iônicas de baixa MM: cromatografia por troca 103 iônica • espécies pequenas e polares, mas não-iônicas: métodos de 104 partição (série homóloga) • espécies não-polares: cromatografia por adsorção (isômeros estruturais, hidrocarbonetos alifáticos) Figura 28 -1 Skoog p 642 vp POLARIDADE DO SOLUTO 105 106 ADSORÇÃO PARTIÇÃO fase reversa fase normal TROCA IÔNICA permeação em gel EXCLUSÃO filtração em gel

Conceitos ü TEMPO DE RETENÇÃO (t. R): é o tempo decorrido entre a injeção da amostra e o aparecimento do pico do soluto no detector de uma coluna cromatográfica. t. R = t E + t M ü TEMPO MORTO ou tempo de retenção da FM (t. M ou t 0): é o tempo necessário para que um soluto não retido passe através de uma coluna cromatográfica. ü TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO (t’R): é igual a (t. R – t. M), ou seja, o tempo que o soluto permanece na fase estacionária. Então t. R = t’R + t. M ou o tempo de retenção, é o tempo total que o soluto permanece na FE (t’R) e na FM (t. M), então: t’R = t. E

Relembrando alguns conceitos Cromatograma t 0 ou t. M t’R W 1/2 Wb Inject Onde: t. R = tempo de retenção t’R = tempo de retenção ajustado t 0 = volume morto Wb = largura da base do pico em unidade de tempo W 1/2 = largura a meia altura em unidade de tempo Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Relembrando alguns conceitos Constante de distribuição: constante de equilíbrio para a distribuição do soluto A entre as duas fases (móvel e estacionária) A (móvel) A (estacionária) A constante de distribuição pode ser manipulada dentro de limites pela escolha apropriada da fase móvel, da fase estacionária ou de ambas. Podemos alterar a razão molar das duas fases pelo ajuste do volume da fase. K= [A]E [A]M n. E/VE K= n. M/VM Fator de retenção: parâmetro experimental importante amplamente usado para comparar as velocidades de migração dos solutos nas colunas. A razão pela qual k é tão útil é que ele não depende da geometria da coluna ou da vazão. Isso significa que para uma dada combinação de soluto, FM e FE em qualquer coluna, com qualquer geometria e operando em qualquer vazão de FM se dará o mesmo fator de retenção, definido como: t‘ t t E k = K V ou VM Separação ideal: k entre 1 e 5. k = R t. M = R – M t M Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Relembrando alguns conceitos Fator de separação: é uma medida da retenção relativa k 2/k 1 de dois componentes da amostra. Onde k 2 e k 1 são os fatores de retenção para os solutos 2 e 1, respectivamente. k 2 = k 1 t t k 2 k = R – M = A substituição da Eq. para os dois solutos na Eq. k 1 t M resulta em uma expressão que permite a determinação de a partir de um cromatograma obtido experimentalmente. (t. R)2 – t. M = (t. R)1 – t. M Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Relembrando alguns conceitos Descrição quantitativa da eficiência da coluna: a eficiência da coluna cromatográfica aumenta à medida que o número de pratos N torna-se maior e à medida que a altura de prato H torna-se menor. L H= N Onde: L = comprimento da coluna H = altura do prato <H >N A origem dos termos “altura de pratos” e “número de pratos” encontra-se em um estudo teórico pioneiro, feito por Martin e Synge, no qual eles trataram uma coluna cromatográfica como se fosse similar a uma coluna de destilação que, em vez de ser constituída por numerosos pratos discretos, apresentava camadas estreitas e contínuas denominadas pratos. Considera-se que em cada prato ocorre o equilíbrio do soluto entre FM e FE. O movimento do soluto através da coluna é, então, tratado como transferência em etapas da FM em equilíbrio de um prato para o próximo. Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Relembrando alguns conceitos Determinação experimental de H e N: o número de pratos pode ser calculado a partir de duas medidas de tempo, t. R e wb; para obter H, o comprimento do recheio da coluna L também deve ser conhecido. Como as determinações experimentais de H e N descritos são baseadas em picos cromatográficos Gaussianos, os cálculos são considerados estimativas. N = 16 t. R wb 2 N = 5, 546 t. R w½ 2 Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa

Cromatografia planar e de coluna

EQUAÇÃO de van DEEMTER B/u = (2 DM) / u Análise Instrumental – Técnicas de separação Profa. Ana Carolina Costa