ANIMALES TRANSGENICOS Cmo fabricar una protena humana Por

ANIMALES TRANSGENICOS

¿Cómo fabricar una proteína humana? Por ejemplo: la insulina se usa para tratar la diabetes. Como podemos producir toda la insulina que se necesita para tratar a 400 millones de pacientes en el mundo?

Con una BACTERIA

Con una Levadura

Con una Célula

PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA

Animales Transgénicos Plásmido (vector de ADN) Plásmido p. CX-EGFP

Animales Transgénicos Otros sistemas • Plantas transgénicas • Animales transgénicos

“Vacas que expresan insulina en la leche” Gen de la Insulina ADN humano Introducción Ovulo de vaca (25 vacas para demanda mundial)

Animales Transgénicos Promotor de las glándulas mamarias ¿Cómo? Gen de la Insulina Direccionamos la expresión!!!

• Transgénesis por retrovirus recombinantes • Transgénesis por microinyección de pronúcleos • Transgénesis por clonación • Transgénesis mediada por espermatozoides

Transgénesis por retrovirus recombinantes

Ventajas -No se requiere visualización del pronúcleo ni usar equipamiento complejo -Menos invasivo -Mayor eficiencia de la transgénesis (50 -70%) Desventajas -Mosaicismo -Inserción al azar -Bajo nivel de expresión -Transgén no mayor a 10 kb

Transgénesis por microinyección de pronúcleos

Recolección de los ovocitos • Obtención de ovocitos a partir de animales sacrificados para consumo - Progreso genético mínimo - Garantía sanitaria escasa - Uso en Investigación Lavado de ovarios Aspiración de los folículos antrales Complejos cúmulus-ovocito

Animales Transgénicos Cultivo in vitro =

Animales Transgénicos Equipo de laboratorio Microagujas

Transgénicos por microinyección de pronúcleos Gordon et al. , 1980 (PNAS)

Transgénesis por microinyección de pronúcleos (+) -Ampliamente usada (-) -Mosaicismo -Baja eficiencia (0, 003 % Bovino) -Inserción del transgén al azar Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Gordon y col. , 1980 (PNAS)

Transgénesis por clonación

Introducción Clonación oveja Dolly Wilmut et al. , 1997 Nature 385, 810– 813.

Tissue culture Fetal cells oocyte 75 Day Fetus FIBROBLAST EXTRACCION DE NUCLEO Enucleated oocyte Cloned calf FUSIÓN CELULAR 7 Days embryo OVULO ACTIVADO CON NUCLEO DE FIBROBLASTO Embryo transfer Recipient cow 278 days

PASOS DE LA CLONACIÓN ENUCLEACIÓN Fotos Cyagra

PASOS DE LA CLONACIÓN TRANSFERENCIA NUCLEAR Fotos Cyagra

Transgénesis por clonación (SCNT ) (+) -Ampliamente usada -Identificar integración del transgén in vitro Cibelli y col. , 1998 (Science) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (-) -Impronta -Eficiencia 1 -3% -Inserción del transgén al azar -Consumo de tiempo

TRANSGENESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES Además del ADN paterno (función natural), el espermatozoide lleva ADN exógeno

Animales Transgénicos Ovocito ESQUEMA DE LA TECNICA espermatozoide llevando el gen exógeno al interior Espermatozoide del ovocito Gen exógeno

Incubación espermatozoides/plásmidos Plásmidos Espermatozoides Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Coincubación

Transgénesis por Espermatozoides ICSI Pipeta de holding Espermatozoide 1 er. CP

Transgénesis por Espermatozoides ICSI Lugar de deposición

Transgénesis por Espermatozoides ICSI Sin espermatozoide

Transgénesis mediada por espermatozoides (+) -Sencilla -Alta eficiencia Brinster y col. , 1981 (PNAS) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (-) -No ha sido usada en rumiantes -Inserción del transgén al azar -Mosaicismo en embriones

Microscopía confocal Núcleo espermático color rojo (IP) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Plásmido marcado color verde (FITC) (1000 x)

Cerdos 60% (R. Olivera) Gatos 26% (Med Vet J. Jarazo) Vacas 23% Caballos 29% Mosaicismo 20 -60%

Rosita. Isa Ganadería Leche humanizada de vaca INTA Balcarce y Univ. de San Martín Bovinos resistentes a la “vaca loca” Richt y col. , 2006.

Transgénicos por Clonación

Medicamento producido por animales transgénicos autorizado por la FDA. GTC Biotherapeutics, Massachusetts.

Producción de órganos para xenotransplante: - Producción cerdos que expresan proteínas humanas que bloquean la acción del complemento (ej. CD 59). - Transplantes de corazón o hígado en forma temporaria hasta la obtención de donante compatible.

Ratones: Modelos de Enfermedades o para Investigaciones

Mutagénesis dirigida en células madre embrionaria • Animales knock-in • Animales knock-out • Animales knock-down

Animales knock-out condicionales: Sistema Cre-lox. P

Animales Transgénicos Pasado Las Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad de los animales de granja en la salud humana. 1796 Edward Jenner, descubre de la “vacuna” antivariólica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicación mundial de la viruela humana

Animales Transgénicos Presente Fermentador como bioreactor para producir vacunas y proteínas recombinantes para la salud humana

Animales Transgénicos Futuro Siempre se escuchan las voces de los detractores del desarrollo científico • En el siglo XVIII y en oposición a la tecnología de Jenner, se dijo: “Existen informes fidedignos de niños que habían empezado a mugir y andar en cuatro patas y de gente con cuernos” por haber sido vacunados. La realidad demostró lo contrario, ¿hoy en el Siglo XXI, escuchamos comentarios similares?