ANALYSE NIPS NON INVASIVE PRENATAL SEQUENCING DIAGNOSTIC PRNATAL

ANALYSE NIPS NON INVASIVE PRENATAL SEQUENCING DIAGNOSTIC PRÉNATAL NON INVASIF DES TRISOMIES 13, 18 ET 21 À PARTIR DU SANG MATERNEL Olivi M. , Mallek R. , Moukoury S. , Kleinfinger P. , Lohmann L. , Costa J. M. Unité de biologie moléculaire génomique, laboratoire CERBA, Saint-Ouen-l'Aumône Septembre 2015

SOMMAIRE } } } Concept Réalisation du test Validation Process routine Perspectives 1

CONCEPT DU TEST: ADN FŒTAL PLASMATIQUE Origine cellulaire: les cellules cyto/syncytiotrophoblastiques Apparition (détection) précoce dans la circulation maternelle ≈ 5 -6 SA Quantité augmente avec le terme de Fetal cell la grossesse Disparition rapide (< 48 h) après Cell isolation accouchement (1/2 vie 16 min) Pas de persistance après grossesse Selon Bodurtha J, Strauss JF III. N Engl J Med 2012; 366: 64 -73. 2

CONCEPT DU TEST: POURQUOI FAIRE DU DPNI? Réduire le risque induit par le geste invasif § Perte fœtale Diminuer le nombre de gestes invasifs § Améliorer le dépistage Risque combiné 1 er trimestre: âge maternel + mesure de la clarté nucale +marqueurs sériques maternels Développer les approches non invasives § Imagerie fœtale § Analyse biologique du fœtus à travers un prélèvement maternel 3

CONCEPT DU TEST: ANALYSE DE L’ADN FŒTAL CIRCULANT YX RHD+ ADN fœtal XX RHD- Détermination du sexe Fœtal: Ø Maladies génétiques liées à l’X Ø Hyperplasie congénitales des surrénales (déficit en 21 -hydroxylase) Ø Ambiguïtés sexuelles échographiques, discordances caryotypes/échographie Intérêt: DPN uniquement chez fœtus masculin Génotypage RHD et Kell Ø K 1/K 2 K 1/K 1 Allo-immunisation K 2/K 2 Intérêt: environ 35% des fœtus sont Rh. D-négatifs Mutations DE NOVO Analyse qualitative Ø Achondroplasie Ø Hypochondroplasie (Recherche de marqueurs fœtaux absents du génome maternel ) 4

CONCEPT DU TEST: ANALYSE DE L’ADN FŒTAL CIRCULANT ADN fœtal Analyse qualitative (Recherche de marqueurs fœtaux absents du génome maternel ) PCR temps réel ( Fret, HRM) et SNa. Pshot Analyse quantitative (Sur-représentation chromosomique fœtale) Aneuploïdies 5

CONCEPT DU TEST: ADN FŒTAL PLASMATIQUE } Challenge: mise en évidence d’une sur-représentation chromosomique dans l’ADN circulant lorsque le fœtus est porteur d’une aneuploïdie } Les difficultés § Quantité faible ü 1 er trimestre: 20 -30 Geq/ml § Fraction fœtale: 5 -10% ü ü Age gestationnel Indice de masse corporelle Anomalies chromosomiques et/ou placentaires Ethnie? § Ne peut pas être isolé 6

CONCEPT DU TEST: 1997 Découverte ADN fœtal plasmatique ? 2011 Diagnostic non invasif de la trisomie 21 (USA) 2013 NIPS (non invasif prénatal sequencing-CERBA) 7

CONCEPT DU TEST: UNE RUPTURE TECHNOLOGIQUE SEQUENÇAGE A HAUT DÉBIT (MASSIVE PARALLEL SEQUENCING) Par run Séquençage SANGER Séquençage NGS Petit débit Séquençage NGS Haut débit Instrument ABI 3130 XL Illimuna Mi. Seq Illimuna 1500 Taille des fragments 500 bp 27 bp Durée 6 h 5 h 34 h Nombre de reads 96 25 millions 1. 5 milliards Capacité 50 KB (50 10+3) 15 GB (15 10+9) 300 GB (300 10+9) (single reads 36 bp) Ratio (single reads 27 bp) X 300 X 6. 000 Génome humain 3 GB Exome humain 30 MB AUDI A 1 105 CH ARIANE 5 21. 500 CH 8

CONCEPT DU TEST: DOSAGE CHROMOSOMIQUE RELATIF PAR MPS § Mesure de fraction chromosomique § Comparaison statistique par rapport à une valeur attendue Fan HC, Quake SR. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics. PLo. S One. 2010 May 3; 5(5): e 10439 9

RÉALISATION DU TEST Pré Analytique Extraction ADN foetal Préparation librairie Sequençage (Hi. Seq 1500) Résultat Analyse Bio-informatique J-x J 1+J 2 J 4 Calcul de la fraction chromosomique =%21 séquences de l’échantillon par rapport au total des chromosomes Calcul du Z-score distance entre le score brut et la moyenne de la population =%21 sample-mean%21 référence/SD médiane%21 référence Interprétation Trisomie 21 -3 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 10

RÉALISATION DU TEST PRÉPARATION DES L’ÉCHANTILLONS J-X • Extraction manuelle de l’ADN plasmatique • Enrichissement • Purification compatible avec les réactions enzymatiques ultérieures Pré Analytique Tube 1 pour extraction Tube 2 pour sauvegarde Extraction ADN foetal ü Par batch de 24 (x 4) ü Mise en plaque 96 soit: • • • Contrôle négatif (NTC No Template Control): 4 Contrôle normal (NPP Normal Pool Plasma): 4 Plasma patientes: 88 11

RÉALISATION DU TEST (J 1) PRÉPARATION DE LA LIBRAIRIE J 1 Enrichissement Un index unique par échantillon Purification et dilution B A Stock plate C HT DNA 1 K/12 K/Hi. Sen Chip Dilution plate moyenne: [nmol/l] Quantification des librairies 12

RÉALISATION DU TEST PRÉPARATION DE LA LIBRAIRIE (J 2) Work plate Normalisation [1, 6 nmol/l] Multiplexage ü Un témoin « low positif » par ligne, soit 8 par flow cell: • • • Trisomie 21 Trisomie 18 Trisomie 13 ü Phi. X 13

RÉALISATION DU TEST CLUSTERISATION (J 2) sur la flow cell Hybridation des librairies simple brin aux amorces fixées sur la Flow Cell Copie du brin fixé (polymérase) Surface en verre de la FC revêtue des oligos sens et antisens Dénaturation des doubles brins générés Elimination de la matrice originale Le brin nouvellement synthétisé est fixé de manière covalente à la FC 14

RÉALISATION DU TEST CLUSTERISATION (J 2) La molécule simple brin se plie pour s’hybrider à l’amorce complémentaire adjacente Formation du « pont » double brin Extension du brin complémentaire par la polymérase Dénaturation des « ponts » Les brins « antisens » sont clivés et éliminés. Ne reste que les brins « sens » Les extrémités 3’ sont bloquées pour éviter qu’elles se re-hybrident 15

RÉALISATION DU TEST SÉQUENÇAGE ( DE J 2 À J 4) Hybridation du primer de séquençage à son brin complementaire Les brins séquencés sont éliminés Terminateur réversible (CRT: Cyclic Reversible Terminator) Déblocage des extrémités 3’ Boxes Pass Filter Boxes Clusters Single read: 27 cycles + 8 pour Index (run: 35 heures) vidéo. I llumina: https: //www. youtube. com/watch? v=HMy. Cq. Whw. B 8 E 16

ANALYSE DES DONNÉES ANALYSE (J 4) Sequencing Result Pipeline informatique Conversion des images en séquence Démultiplage Alignement contre le genome humain (hg 19) ANALYSE Calcul de la fraction chromosomique TCCGCCCAGGCCATGAGGGACCTGGAAATGGCTGAT x 9 10+6/échantillon =%21 de l’échantillon par rapport au total des chromosomes Calcul du Z-score: représente la distance entre le score brut et la moyenne de la population =%21 sample-mean%21 référence/SD médiane%21 référence Mesure de la fraction d’ADN fœtal 17

DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS Calcul du Z-score =%21 sample-mean%21 référence/SD médiane%21 référence 21 -3. 00 0. 00 3. 00 6. 00 9. 00 12. 00 15. 00 18. 00 21. 00 24. 00 27. 00 30. 00 Distribution « normale « des séquences pour la population de référence 99, 8% Un Z-score de 3 signifie que la valeur mesurée est distante de 3 écarts-types de la valeur cible. La probabilité de trouver une valeur à l’extérieur est de 0, 17% pour une distribution normale. Si une valeur est à l’extérieur, cela ne peut s’expliquer par les simples fluctuations statistiques. Z-score >3 signe une sur-représentation chromosomique 18

RÉALISATION DU TEST ET VALIDATION } Critères de validation du run ü Témoins NTC ü Témoins normaux NPP ü Témoins « low » Positifs } Critères de validation individuels ü ü Concentration de la librairie >7, 5 n. M Total counts (reads) > 9 millions Mesure de la fraction fœtale > 4% Analyse des Z-scores 19

SYNTHÈSE VALIDATION DU TEST NIPS CERBA Questions avant la mise en place du test: üQuelles sont les performances du test ? üA qui peut-on ou doit-on proposer ce test ? üJusqu’où aller dans l’analyse? üSous quelles conditions? Validation: 1 - Vérification du process Echantillons: 176 Trisomie 21: 6 Trisomie 18: 2 Trisomie 13: 2 üCollaboration SEQUENOM üTransfert technologique üValidation de la faisabilité et des compétences techniques Mise en contrôle: 4 20

SYNTHÈSE VALIDATION DU TEST NIPS CERBA 2 - Vérification des performances (étude pré-clinique multicentrique SHREK, patientes à risque) comparaison test NIPS Cerba vs caryotype fœtal (gold standard) ü Population mixte: caryotype fœtal connu + patientes à risque devant subir un geste invasif • Clarté nucale élevée • Signe d’appel échographique autre que nuque • Marqueurs sériques ≥ 1/250 • Antécédent personnel ou pour le couple d’anomalie chromosomique • Age maternel>38 ans ü Echantillon sanguin prélevé soit à priori, soit en post-caryotype ‒ Age médian 37 ans (range 23 -50) ‒ Terme médian 13 SA (range 11 -31) 21

29 CPDPN + Belgique et Monaco SYNTHÈSE VALIDATION DU TEST NIPS CERBA 3 - Validation clinique (étude multicentrique SEHDA, patientes à risque) Coordination et collection des données: Pr A Benachi et Dr A Letourneau (Hôpital Antoine Béclère, Clamart) Comparaison test NIPS Cerba vs caryotype fœtal ü Population mixte: caryotype fœtal connu + patientes à risque devant subir un geste invasif • Clarté nucale élevée • Signe d’appel échographique autre que nuque • Marqueurs sériques ≥ 1/250 • Antécédent personnel ou pour le couple d’anomalie chromosomique • Age maternel>38 ans ü Echantillon sanguin avant geste invasif (amniocentèse ou CVS) • Terme moyen : 16. 2 SA (range 10 -35) • Age moyen : 35 ans (range 18 -49) ACCREDITATION COFRAC: avril 2015 22

ETUDE DEPOSA: Dépistage combiné du 1 er trimestre vs NIPS en population générale grossesse spontanée vs assistance médicale à la procréation DEPOSA Etude multicentrique, Etude prospective (durée 18 mois), Etude interventionnelle, Promoteur: AP-Hôpitaux de Paris Autorisation ANSM: 2014 -AO 1594 -43 Investigateur coordonnateur : Alexandra BENACHI Responsable Scientifique: Jean-Marc COSTA Financement: Agence de la Biomédecine, Laboratoire CERBA, Laboratoire SEQUENOM, Intériale Mutuelle 23

EN ROUTINE AU LABORATOIRE CERBA } Absence d’anomalies échographiques } Terme ≥ 10 SA } Patientes à risque accru (recommandations) • § § § Dépistage par les marqueurs sériques ≥ 1/250 Antécédent pour le couple d’une grossesse avec aneuploïdie 13, 18 ou 21 Couple dont l’un des membres est porteur d’une translocation robertsonienne impliquant un chromosome 13 ou 21 Patiente âgée de plus de 38 ans n’ayant pas pu bénéficier du dépistage sérique } Patientes à bas risque: indications retenues § § Grossesse gémellaire Dépistage par les marqueurs sériques: avec un marqueur hors norme (sous-évaluation du risque) } Résultat § § § Actuellement trisomie 13, 18 et 21 Ne sont pas communiqués: anomalies des gonosomes et sexe fœtal, autres aneuploïdies (trisomie 16 et 22) et syndromes micro-délétionnels. Tout résultat positif nécessite un contrôle sur prélèvement invasif Ce test ne doit pas se substituer actuellement au dépistage par les marqueurs sériques et à l’échographie du 1 er trimestre 24

EN ROUTINE au Laboratoire CERBA Tests réalisés: 1994 Nombre de tests: } 2014: 3319 } Août 2015: 3702 (fin août 2014) Prescripteurs>90 Centres>570 Marqueur sérique 1488 Age maternel 208 Antécédent 109 Divers 189 Résultat non exploitable: Contrôle: 9 1 soit 0, 05% (IMC: 27, 3) Anomalie: 68 Soit 3, 41% Négatif: 1925 Trisomie 21 N=54 Trisomie 18 N=10 Trisomie 13 N=4 AU TOTAL : réduction de 96, 6% des gestes invasifs 25

FAUT-IL PROPOSER CE TEST À TOUTES LES PATIENTES? } Sensibilité et spécificité supérieure à celle du dépistage par les marqueurs sériques maternels ü Détection de plus de fœtus porteur d’une trisomie 21 § Dépistage « conventionnel » : 80 -85% § Dépistage génétique : >99% ü Diminution du nombre de gestes invasifs § Dépistage « conventionnel » : 4% (soit 30. 000 femmes/an en France) § Dépistage génétique : 0, 4% (soit 3. 000 femmes/an en France) ü Diminution du nombre de pertes fœtales iatrogènes 26

POURQUOI NE PEUT-ON PAS PROPOSER CE TEST À TOUTES LES PATIENTES? } Coût (650€) } Délai de résultat: de 7 jours à 14 jours } Accessibilité au test (lire avis n° 120 du CCNE) Respect des recommandations nationales ü Comité Consultatif National d’Ethique. Avril 2013 ü Collège National des Gynécologues et Obstétriciens Français. Avril 2013 Questions éthiques associées au développement des tests génétiques fœtaux sur sang maternel } Peu d’étude en population générale (DEPOSA en cours) Impact sur la valeur prédictive positive du test } Formation et information des professionnels de santé 27

PERSPECTIVE À COURT TERME : L’ÉTUDE COMPLÈTE DU GÉNOME FŒTAL DOSAGE CHROMOSOMIQUE FŒTAL PAR MPS: VERS UN CARYOTYPE COMPLET… 28

AVANTAGE DE L’APPROCHE « WHOLE GENOME » § § § Femme de 40 ans Echographie 12+5: clarté nucale à 3, 8 mm Biopsie de villosités choriales 13+2 § § Examen direct : 46, XX Culture: délétion interstitielle du bras court d'un chromosome 10 entre les bandes 10 p 12 et 10 p 14 29

DPNI ET DÉRIVES «Marché» accessible via internet Séquençage complet: faisabilité technique et offre déjà existante