Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse

Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) Par Helena ALVES- REMY NAMC, équipe communication chimique CNRS, UMR 8620 Université Paris Sud, bât 446 ORSAY. Octobre 2004

LIPIDES Définition : Molécules insolubles dans l’eau, mais solubles dans les solvants organiques non polaires comme l’éther, le chloroforme, le méthanol ou le cyclohexane.

Lipides simples : • Alcools, aldéhydes, acides, esters gras • Acylglycérols (MG, DG, TG) • Stérols • Hydrocarbures (alcanes, alcènes, ß-carotène, . . ) • Quinones (vit. K, coenzyme Q) • Céramides • Cires • Lipides aminés (dopamine, …)

Lipides complexes : • Phospholipides (PE, PI, PC, PS, SM, …) • Glycolipides (groupes sanguins, …)

Mise en évidence des différentes classes de lipides Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ou Thin Layer Chromatography (TLC)

Chromatographie Définition: Méthode de séparation des constituants d’un mélange qui utilise deux phases non miscibles: • Une phase stationnaire qui établit des liaisons +/- fortes avec les molécules à séparer • Une phase mobile qui entraîne et décroche les molécules retenues sur la phase stationnaire.

CCM lipides • Phase stationnaire = Gel de silice • Phase mobile = 4 mélanges de solvants différents Migration • Visualisation des spots: sous UV après vaporisation de Primuline.

Lipides totaux transportés par la lipophorine • Lipophorine: lipoprotéine hémolymphatique spécialisée dans le transport des lipides chez les insectes. • Lipides totaux extraits par un mélange Méthanol – Chloroforme (1: 2, v/v).

Hydrocarbures Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 DG 1, 2 Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 DG 1, 2 Stérols Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 DG 1, 2 Stérols MG Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 DG 1, 2 Stérols MG PE Lipides transportés par la lipophorine

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 DG 1, 2 Stérols MG PE PC Lipides transportés par la lipophorine

Identification individuelle de chaque lipide Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse ou GC-MS

Chromatographie en phase gazeuse ou CPG: • Phase mobile = éluant gazeux inerte (He, H 2, N 2) qui entraîne le mélange à analyser. • Phase stationnaire, fixée sur un support inerte, retient +/- les constituants du mélange.

Injection à haute température CPG s’applique aux gaz et aux composés susceptibles d’être vaporisés sans décomposition à haute température

Réactions de dérivation des lipides Alkylation; Silylation En masquant les fonctions polaires, elles permettent d'augmenter: • la volatilité • la stabilité • la détectabilité

Alkylation: réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements alkyles

Silylation: réduit la polarité des lipides en remplaçant les H actifs par des groupements triméthylsilyl ou tert-butyl-diméthyl-silyl (t. BDMS)

Séparation des lipides dans la colonne capillaire

Phase stationnaire apolaire de type BP-X 5 = Polymethylphenylsiloxanes

Le détecteur de masse

Electrons cibles de l’impact électronique • Électron arraché, par ordre de préférence: • 1) électron des doublets n (O, N, …) • 2) électron Π (double liaison) • 3) électron σ • Réarrangements moléculaires • Rupture de liaisons • Les fragments chargés + sont détectés.

Acides gras libres (AGL) avant dérivation :

Esters méthyliques d’acides gras :

AGL après silylation :

Standard de distéarine après silylation

Spectre de la tricaprine

TG composé de 3 AG différents

Mécanismes de fragmentation des acyl-sn-glycérols:

1, 3 -dimyristine

1, 2 -dimyristine

Hydrocarbures ramifiés: Formation de carbocations secondaires

Localisation des doubles liaisons: dérivation au DMDS

Spectre du 7 -pentacosène

Phéromones chez Drosophila melanogaster Femelle 7, 11 Heptacosadiene 1 7 8 11 12 27 CH 3 -(CH 2)5 -CH=CH-(CH 2)2 -CH=CH-(CH 2)14 -CH 3 w 5, 9 Heptacosadiene 1 5 6 9 10 27 CH 3 -(CH 2)3 -CH=CH-(CH 2)2 -CH=CH-(CH 2)16 -CH 3

Phéromones chez Drosophila melanogaster Mâle

Identification des phospholipides • 1) identification du type de PL par CCM grâce à la co-migration de standards • 2) identification des AG estérifiés par GC-MS

Hydrocarbures Triglycérides AGL DG 1, 3 DG 1, 2 Stérols MG PE PC Lipides transportés par la lipophorine

Analyse des spots correspondant à PE et à PC par GC-MS

L’analyse des lipides par GC-MS permet : • d’identifier les AG libres • d’identifier les AG estérifiés dans les MG, DG, TG et PL • de distinguer entre DG 1, 2 et 1, 3 • d’identifier les hydrocarbures • de localiser la position d’une ramification • de localiser la position d’une double liaison • d’identifier les stérols