Alkoholdehydrogenas ADH labb Biokemi 1 HT11 Linda Helmfors

Alkoholdehydrogenas – ADH labb Biokemi 1 – HT-11 Linda Helmfors liand@ifm. liu. se (linda. helmfors@liu. se)

Dehydrogenaser • Enzymer som katalyserar överföring av väte kallas med ett samlingsnamn för dehydrogenaser • Alkoholdehydrogenas (ADH) katalyserar oxidation av alkoholer -> aldehyder • ADH kräver närvaro av koenzymet NAD+ för aktivitet • ADH är ett gruppspecifikt enzym. Snabbast reaktion med etanol men även andra alkoholer fungerar ADH 2 NAD+

Labben • Blanda olika alkoholer med ADH och NAD+ • Mäta absorbansändringen • Beräkna reaktionshastigheten 3

Reaktionen vi studerar ADH-NAD+ + R-CH 2 OH ⇌ ADH-NADH + R-CHO + H+ 4

Hur kan vi mäta reaktionshastigheten? • Vi kan mäta reaktionshastigheten genom att mäta spektrofotometriskt vid 340 nm • NADH absorberar ljus till skillnad från NAD+ • 1 mol NADH 1 mol alkohol • Absorbansökningen per tidsenhet är ett mått på reaktionshastigheten 5

Reaktionshastighet • E mättat på [S] • Allt E förekommer som [ES] • [E]Tot = [ES] • VMax beror av [E] Under dessa beting mäter vi 6

Absorbans jämfört med reaktionshastighet Konstant hastighet Ger oss hastigheten i min-1 men vi vill ha µmol/min 7 Överskottet substrat är slut => Reaktionen har nått jämvikt

Beräkningar • Lambert-Beers lag: • A absorbansenhet • ε ämnesspecifik konstant, här för NADH 6, 22 ∙ 103 M-1 cm-1 • l strålens väg genom kyvetten i cm • c koncentration av NADH i kyvetten i M • Kan skrivas om: 8

Beräkningar forts. M/min Detta vill vi göra om till mol/min Skriv sedan i µmol/min i tabellen 9

Laborationsredogörelse: • Rubrik: Laborationens namn • Resultat: • Rådata (invägda mängder, spädningar, direkta mätresultat ) tydligt redovisade, gärna i tabellform: Alkohol 10 Mängd ADH Absorbans 1 Absorbans 2 Tid 1 Tid 2 • Redovisade uträknade resultat baserade på mätdata – Tydligt! • Graf över reaktionshastigheten som funktion av enzymmängden

Laborationsredogörelse forts: • Ifylld tabell över resultat Substrat ADH (µl) ADH (mg) ∆A/∆t (min-1) v (µmol/min) v 100/vetanol • Resultattolkning/Diskussion: Värdering av resultat och egna slutsatser samt svar på eventuella frågor ställda i laborationshandledningen. • Lathund över vanliga returer kommer att sitta uppe på labb 11

Kommentarer till returer - ADH 1. Beräkningarna behöver justeras 2. Grafen saknar enheter/fel enhet 3. Uppdatera tabellen och grafen 4. Utvecka diskussionen över resultatet 5. Redovisa beräkningarna med exempel från egna värden 6. Graf saknas 7. Tabell över rådata saknas 8. Diskussion saknas

Förberedelser • Läs labbhandledningen innan labben • Fundera över: 13 • Vilka data behöver vi samla in för att beräkna V? • Vad förväntar vi oss för resultat?

Labben i korthet 1. Reaktionen utan enzym: NAD+ + Et. OH, blanda -> mät 2. Reaktionen med enzym: NAD+ + Et. OH + ADH, blanda snabbt > mät 3. Upprepa för reproducerbarhet 4. Upprepa (2) med olika volym ADH 5. Upprepa med olika alkoholer 14

Vi ses på labb!