Agenti chimici Agenti fisici Agenti biologici PROTONCOGENI Gene

Agenti chimici Agenti fisici Agenti biologici PROTONCOGENI (Gene normale) altamente conservati nelle varie specie nel corso dell’evoluzione i loro prodotti esplicano funzioni essenziali ONCOGENI geni capaci di indurre lo sviluppo di un tumore producono proteine abnormi nella struttura e nella funzione

Dominanti

Recessivi

Immortalizzazione Trasformazione Progressione neoplastica

Alterata struttura Alterata regolazione

1911 -Peyton Rous discovers a “filterable agent” in extracts of chicken tumors that can induce new tumors when injected into otherwise normal chickens. (Nobel Prize) Filterable substance is later identified as a virus that had an RNA genome instead of DNA and is thus termed a “retrovirus”. Retroviruses have three basic genes: Group Antigen Gene (GAG), nucleo-capside a special Polymerase (POL), RT and viral envelop proteins (ENV).

1970 -Temin and Baltimore discovered that the POL enzyme can “reverse-transcribe” or direct DNA synthesis from an RNA template (Nobel Prize). Two types of the retroviruses identified: transforming and non-transforming. 1970 -Isolation of an additional genetic element termed SRC from transforming Rous sarcoma viruses that is directly responsible for causing cancer (an oncogene).

Ciclo vitale del Virus del Sarcoma di Rous che contiene l’oncogene src

L’oncogene src codifica per una proteina di pm 60000 è una protein-chinasi Ha un’attività enzimatica che attaccava ioni fosfato agli aminoacidi di altre proteine substrato, in particolare alla tirosina (generalmente la fosforilazione avviene in treo e ser)

Le sequenze virali: v-onc furono identificate non solo nel pollo ma anche in altre specie filogeneticamente lontane

1976 -Varmus and Bishop discovered that normal cells contain a homolog of the oncogene v-src. Thus, all normal cells contain potential cancer causing genes (Nobel Prize). All v-onc genes have normal cellular homologs. 1983 -Hanafusa elucidated the mechanism by which normal cellular oncogenes are acquired by retroviruses.

Gli oncogèni sono presenti in tutte le cellule normali, necessariamente essi devono servire a funzioni estremamente importanti e fondamentali Pertanto i virus oncogeni non erano più da considerarsi entità biologiche comparse prima delle cellule eucariotiche, ma al contrario dovevano costituire una forma biologica evolutasi successivamente, per favorire lo scambio di informazioni genetiche tra diverse specie animali e vegetali (Dulbecco 1984).

Durante l’evoluzione alcuni retrovirus privi di v-onc hanno acquisito tali geni dalle loro cellule ospiti per ricombinazione genica durante la replicazione virale Gli stessi retrovirus possono poi reintrodurli nelle cellule ospiti infettate v-onc

Retrovirus lenti C-myc Ltr del virus codifica per i prodotti virali che vanno a controllare in modo anomalo funzioni essenziale della cellula Retrovirus trsformanti acuti V-onc

1982 -Weinburg transforms mouse fibroblasts with human DNA derived from bladder carcinoma cells. Those cells that become transformed have a human gene homologous to v-ras. First demonstration that an oncogene can cause human cancer. Over 50 oncogenes and proto-oncogenes have been identified by studying oncogenic viruses and transforming genes from human and animal tumors.

Studi ulteriori hanno dimostrato la presenza nelle cellule normali di: Esistono nel genoma umano protooncogeni mai trasferiti a retrovirus Questi geni sono presenti nelle cellule tumorali Amplificati o Mutati

Geni per l’immortalizzazione Geni per l’apoptosi Geni per il controllo dell’angiogenesi Geni per l’invasività Geni per le metastasi Geni per favorire l’accumulo di mutazioni

Meccanismi di attivazione degli oncogeni e loro effetti sull’espressione genica

Meccanismi di riparazione del DNA Oncogeni Amplificatione genica Overexpressione genica Mutatione attivante Geni oncosoppressori CANCRO Alterazioni epigenetiche Ipermetilazione dei promoter Deletione Mutatione inattivante Ipermetilazione

Un retrovirus può convertire un proto-oncogene a un oncogene alterando le sequenze geniche La proteina codificata avrà un’attività abnorme Un proto-oncogene può diventare oncogene quando è spostato sotto il controllo di promoter o enhancer del genoma virale

Es: ras

Proliferazione Mutazioni puntiformi dei geni della famiglia RAS sono l’anomalia singola più comune di oncogeni trasmesse come caratteri autosomici domananti nei tumori umani (15 -20%)

Nelle cellule tumorali possono essere presenti molte copie dello stesso gene sia geni normali sia geni mutati C-myc microcitoma N-myc neuroblastoma

Trasferimento di un frammento di cromosoma Tumori mesenchimali (Recombinasi) Traslocazione c-myc Controllo ciclo cellulare alterato Linfoma di Burkitt traslocazione di c-myc -t (8, 14) (90% dei casi) -t (8, 22)

Leucemia linfoide acuta a cell T Traslocazione (8. 14) della catena α del TCR in contatto con c-myc

Inserzione del gene trasferito sul sito di un altro gene Gene ibrido Prodotto abnorme Leucemia mieloide cronica t(9, 22) (q 34, q 11) Il protooncogene abl viene traslocato e fuso in un sito bcr (Breackpoint Cluster Region) Il prodotto bcr/abl è una proteina p 210 con una potente attività tirosinchinasica

Leucemia mielomonocitica acuta, unv 16 (p 16, q 22) Leucemia mieloide acuta Inv 3 (q 21, q 26) Linfomi a cell T Inv 14 (q 11, q 32)

Eventi epigenetici: Sono ereditati dalle cellule figlie ma non sono dovuti ad alterazione dell’informazione genetica Attività telomerasica Siti fragili Instabilità cromosomica di alcune regioni ricche di CGG O CCG Metilazione

Possono agire singolarmente o in sinergia Alcuni sono segnali negativi Proteine aberranti con omologie con i GF Eccesso di GF Innesco di un meccanismo autocrino di stimolazione alla proliferazione Es: p 28 sis omologo PDGF Cellule (coinvolte nella riparazione dei tessuti: fibroblasti, endoteliociti, c muscolari lisce) con recettori per il PDGF continuamente stimolate Glioblastomi producono PDGF e rec PDGF Sarcoma: Scimmia, gatto Spesso altri oncogeni inducono iperespressione (ras) di GF e rec GF

Le cellule mostrano un elevato n° di recettori per amplificazione oppure possono mostrare recettori strutturalmente e funzionalmente aberranti GUADAGNO DI FUNZIONE

Recettori Tirosinchinasici: poco espressi nelle cellule normali AEV erb-b recettore troncato dell’EGF AEV erb-a recettore per l’ormone tiroideo Sarcoma felino v-fms forma del rec di MCSF Sarcoma felini v-kit forme attiva del rec per Stem Cell Factor

ERB B 1, gene normalke del EGFR è iperespresso: 80% del ca squamocellulare del polmone, 50% glioblastomi, 80 -100% t. testa-collo ERB B 2, HER-2/NEU è amplificato: 25% ca mammella e ovaio, polmone, stomaco e ghiandole salivari Monoclonali che contrastano l’attività di EGFR CETUXIMAB ERLOTINIB GEFINITIB

RET è normalmente espresso nelle c neuroendocrine e interagisce con il fattore neurotrofico derivato dalle c gliale promuovendo la sopravvivenza cellulare durante lo sviluppo neuronale RET è normalmente espresso in cellule neuroendocrine: Cellule. C parafollicolari della tiroide Cellule della Midollare del Surrene Cellule parafollicolari Mutazione del recettore ret trasmessa per via germinale Carattere autosomico dominante Neoplasie del sistema endocrino MEN-2 B MEN-2 A: ca midollare della tiroide, surrene e paratiroidi MEN-2 B: ca tiroide e surrene MEN-2 B

1. Interazione ligando-recettore 2. Riorganizzazione del recettore e autofosforilazione delle strutture intracitoplasmatiche 3. Interazione con proteine citoplasmatiche 4. Messaggio nel nucleo Oncogeni codificano: Proteine leganti la guanosina trifosfato e Protein chinasi di tipo non recettoriale

Proteine G eterotrimeriche legano nucleotidi guanilici

Ras- mutato legano GPT più a lungo diversa attività GTPasica Mutazioni ras ubiquitarie nei tumori solidi, linfoidi e mieloidi K-ras: sarcoma murino indotto dal virus di Kirsten H-ras: sarcoma murino indotto dal virus di Harvey N-ras: neuroblastomi e carcinomi presenti anche nell’uomo Riduzione dell’attività GTPasica Le mutazioni di ras si manifestano Facilitazione del distacco di GDP Alcuni tumori hanno mutazioni in proteine presenti sulla via di ras Le proteine di ras fungono da mediatori tra i recettori per i GF e gli effettori mitogenici coinvolti a valle nella proliferazione e nel differenziamento cellulare

Mutazioni dei geni ras sono coinvolti nel processo di iniziazione della cancerogenesi Modello di cancerogenesi di Beremblum Ras mutato o alterazioni a monte si riscontrano nel 15 -20% dei tumori umani 90% adenocarcinomi e colangiocarcinomi del pancreas 50% ca colon, endometrio e tiroide 30% adenocarcinomi del polmone e leucemie mieloidi

RAS Le proteine ras sono un componente essenziale nei meccanismi di segnale tra i recettori per i fattori di crescita e i loro effettori. I geni della famiglia ras codificano per proteine ad alta omologia Le proteine di ras sono delle proteine G, piccole GTPasi Controllano meccanismi molecolari molto complessi Mutazioni di ras sono state evidenziate in numerosi tipi di tumore

Nell’uomo sono stati isolati tre geni altamente omologhi. Hras, Kras e Nras che codificano per tre proteine di PM 21 k. Da Le tre isoforme correlano in modo diverso con le varie neoplasie e con la prognosi Alcune mutazioni di queste isoforme ricorrono più frequentemente nei diversi tumori

L’attività tirosin-chinasica nelle cellule normali è scarsa L’aumento di fosfotirosina è un marker di malignità Substrati di proteine con attività tirosichinasica possono essere: Enzimi Proteine di trasporto Proteine del citoscheletro Proteine di adesione Fattori di trascrizione

Pp 60 del virus sarcoma di Rous Sito di regolazione Delezione Tyr 527 Riarrangiamento e attivazione dell’attività chinasica

Fattori che controllano direttamente la regolazione di geni, legando specifiche sequenze di DNA

jun fos Activator Protein 1 (AP-1) È un fattore di trascrizione costituito da fos e jun Regolato da una serie di fattori: citochine. fattori di crescita, stress, infezioni batteriche e virali Controlla numerose funzioni cellulari: proliferazione, differenziazione e apoptosi Traslocazioni cromosomiche attivano fattori di trascrizione

MYC è espresso in tutte le cellule eucariote, viene attivato quando le cellule quiescenti ricevono un segnale di divisione Attività modulate da MYC: Acetilazione degli istoni, riduzione adesione cellulare, aumento motilità cellulare, aumento telomerasi, aumento sintesi proteica Apoptosi c-myc appartiene ad una famiglia di geni: N-myc (neuroblastoma)e L-myc(microcitoma) Come fattore di trascrizione funziona da repressore e in alcuni casi da attivatore Splicing alternativo: c-Myc 1 e c-Myc 2 Progressione del ciclo cellulare c-Myc 1 Morte per apoptosi, senza segnali di sopravvivenza quando attivato

Myc-Max attivatori della trascrizione genica Max-Max inibitori Myc risulta iperespresso in numerose neoplasie maligne: Leucemie, ca del colon, ovaio e polmone, ecc

Cicline e chinasi ciclino-dipendenti Oltre 15 cicline DEAB CDK fosforilano proteine che guidano il cicli cell CDK I sono spesso mutate o inibite in neoplasie umane: Ca pancreas, glioblastomi, esofago, leucemie, polmone, vescica CDK I

Contrastano lo sviluppo di neoplasie Regolano la proliferazione cellulare Controllano i meccanismi di pausa del ciclo cellulare Avvio ai processi di riparazione del DNA Differenziazione Morte cellulare Sono colpiti da mutazioni inattivanti

Esperimenti di fusione cellulare Esperimenti di micronucleazione Analisi del cariotipo delle cellule tumorali Meccanismo oncogeno degli Onco. DNA virus

Nelle cellule tumorale i geni oncosoppressori risultano: Perduti Delezione genica Alterati mutazioni Repressi ipermetilazione La mancata funzione dei geni oncosoppressori provoca trasformazione e progressione neoplastica

Caratteristiche del cancro ed oncosoppressori Proliferazione autonoma: Rb, p 53. APC, NF 1 Resistenza all’apoptosi: P 53, PTEN Insensibilità ai segnali di inibizione della crescita: Rb, DPC 4 Invasività e metastasi. CDH 1 Angiogenesi. VHL Resistenza alla senescenza: Rb, p 53

Processo oncogenetico multifasico : “ teoria dei due colpi “ di Knudson Due eventi mutazionali Un allele del gene oncosoppressore può essere ereditato mutato da uno dei due genitori (eterozigosi), l’altro viene inattivato da un evento mutageno occasionale(omozigosi)

Cicline : Proteine regolatorie attive in particolari momenti del ciclo cellulare How do the cells over come these checkpoints? i. e. the negative controls in resting cells that prevent cell cycle progression? Positive signals like: Hormones (insulin) Growth factors (PDGF) Cytokines (interleukins, IL 1 -18) Rb e p 53

Oncosoppressori: Rb e p 53 Espressione genica: Fos, jun, myc Cicline Fattori di crescita (controllo pos): EGF, FGF, PDGF, TGFα IGF I, IGF II Fattori negativi: IFN, TGFβ, TNF

Primo oncosoppressore identificato associato alla comparsa di retinoblastoma

Il retinoblastoma è un tumore raro che colpisce la retina 1 su 20000 tra bambini e neonati 60% sporadico, 40% ereditario

Retinoblastoma Colpisce i due sessi in età infantile Forma precoce (60%): entro 15 mesi di vita Multifocale, bilaterale, tendenza ad altre neoplasie Forma tardiva (40%): si manifesta tra i 4 e 5 anni Teoria difasica Nella forma precoce la prima mutazione è prezigotica La seconda è casuale Le mutazioni/delezione di Rb è associata a numerose neoplasie umane e animali Elevato rischio di osteosarcomi, ca della mammella, ca a pioccole cellule del polmone e ca della vescica

Gene Rb P 105 RB Fosfoproteina nucleare fondamentale nella regolazione del ciclo cellulare E’ espressa in tutte le cellule

p 105 ipofosforilata lega il fattore E 2 F blocca il ciclo cellulare p 105 iperfosforilata libera il fattore di trascrizionepassa E 2 F Si complessa con DP 1 e passa nel nucleo dove attiva geni indispensabili per la replicazione del DNA e protooncogeni: es myc e myb che determinano l’avanzamento della cellula della fase G 1 alla fase S Rb esercita la sua azione modulatrice con intensità diversa nei vari citotipi

Rb è anche coinvolto nell’arresto irreversibile del ciclo della proliferazione: senescenza Rb è coinvolto nel differenziazione cellulare: Regola fattori di trascrizione tessuto-specifici Mutazioni Rb nei tumori umani sporadici Altri geni possono mimare la funzione di. Rb Carcinoma a piccole cellule 90% Carcinoma non a piccole cellule 10 -15% Ca prostata 20% Ca mammella 10% Ca vescica 20 -50% Leucemia mieloide cronica 20% Glioma 15 -20% Ca esofago 15 -50% Ca fegato 15 -30%

P 105 mutato lascia il fattore E 2 F continuamente disponibile per la trascrizione genica Delezione o legame con proteine virali p 105 iperfosforilato

Viral oncoprotein Simian virus 40 Adenovirus Host cell tumor suppressor protein large T antigen p 53 E 1 b E 1 a Human papillomavirus E 6 E 7 Rb

p 53 fosfoproteina nucleare che funziona da fattore trascrizionale in grado di legare sequenze di DNA Controllo della proliferazione Attivano i meccanismi di riparazione al DNA danneggiato Apoptosi

Ipossia Erosione dei telomeri Privazione dei fattori di crescta Attivazione degli oncogeni

E’ attiva come tetramero, anche mutazioni di un solo allele risultano in una p 53 inattiva molto più stabile Ha una breve emivita Viene inattivata da MDM 2

Interazione con il DNA Interazione con p 53 Autoinibizione Attiva geni che inibiscono la progressione del ciclo cellulare e inibisce quelli che ne favoriscono la progressione Il gene mutato perde la capacità di agire come attivatore trascrizionale dei geni coinvolte nel ciclo cellulare Mutazioni e delezioni

P 53 mutata è molto frequente nei tumori umani sporadici Ca ovarici ed esofagei 50% Ca colon-retto pancreas e polmone 40 -50% Utero e mammella 25 -30% Sarcomi 15 -20% Sindrome di LI Fraumeni: Mutazione germinali di p 53 Alto rischio all’insorgenza di: Sarcomi, leucemie, neoplasie alla mammella 30% entro i 30 anni 90% dopo i 65 anni

Mutazioni di p 53 sono associate ad una ridotta risposta ai chemioterapici e alla radioterapia

Care taker (curatori):