AFLP amplified fragment length polymorphism Alternativa k RAPD

„AFLP, amplified fragment length polymorphism“ • Alternativa k RAPD na bázi DNA fingerprintingu nabízí metoda AFLP (česky polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů) (Vos et al. 1995) • Multilokusová analýza AFLP má mnohem vyšší schopnost rozlišení polymorfismu alel než metoda RFLP (Barker et al. 1999) a je velmi vhodnou technikou pro studium genetické variability na úrovni druhů či populací u široké škálu organismů (např. Liu et al. 1998, Wang et al. 2004, Uthicke et Conand 2005) • možnost rychle vygenerovat velké množství polymorfních markerů i u druhů, o nichž nemáme jedinou předchozí genetickou informaci • Princip metody: technika AFLP kombinuje výhody osvědčeného principu PCR (polymerase chain reaction) a štěpení restrikční endonukleázou pro získání specifických selektovaných restrikčních fragmentů celkové DNA jakéhokoli jedince, tedy napříč genomem, za vysoké míry opakovatelnosti pokusu. • „nevýhody“: dominantní marker s občas nejistým původem a homologií fragmentů, finančně dražší metoda, komplikovanější protokol

„AFLP, amplified fragment length polymorphism“ Využití • vhodnost AFLP markerů při studiu hybridizace, introgrese, definice klonů, polyploidů, stanovení genotypu (vyšší variabilita oproti konzervativním alozymovým lokusům) • určování paternity díky variabilitě a vysoké míře reprodukovatelnosti výsledků • systematika, fylogeneze, fylogeografie • populačně-genetické studie: vnitro- a mezipopulační variabilita, kvantifikace genového toku, podobnost/rozdílnost mezi populacemi • AFLP protokol na: http: //www. natur. cuni. cz/~muncling/prakt. GM. htm (Projekt FRVŠ 813/2008)

AFLP, princip metody 1. restrikce: specifické rozštěpení celkové DNA dvěma restrikčními endonukleázami: Mse. I - rozpoznává 4 bp dlouhou sekvenci (TTAA) a Eco. RI rozpoznává 6 bp (GAATTC) velké množství fragmentů, mají na jednom konci Mse. I a na druhém Eco. RI štěpné místo 2. ligace: T 4 ligázou jsou k fragmentům připojeny specifické adaptory, tím známe sekvence začátků a konců všech fragmentů 3. preselektivní amplifikace: redukce vysokého počtu fragmentů, PCR s primery komplementární adaptorům, avšak o 1 bázi delší a přesahují tak "dovnitř" studovaného fragmentu, namnoží se tak pouze 1/4 všech fragmentů (pouze ty s komplementární bázi), tj. se 2 primery je amplifikována pouze 1/16 fragmentů (1/4 x 1/4) 4. selektivní amplifikace: další redukce s primery se třemi selektivními nukleotidy (přesahy "dovnitř" studovaných fragmenty, amplifikována je pouze 1/256 všech fragmentů (1/16 x 1/16) 5. visualizace a vyhodnocení: s flourescenčně značeným Eco. RI primerem můžeme k vyhodnocení fragmentů využít automatický sekvenátor převedení na 0 -1 matici (presence/absence fragmentu), výpočet párových koeficientů genetické vzdálenosti (Nei, Jaccard. . . ), konstrukce stromu pomocí UPGMA, neigbour-joining. . .