ADN recombinante Dr Luis A Mora B Ctedra

ADN recombinante Dr. Luis A. Mora B. Cátedra de Bioquímica UCIMED

IMPORTANCIA BIOMÉDICA Diagnóstico v Medicina forense v Terapia génica v Producción de medicamentos v insulina factores de la coagulación activador del plasminógeno hormona de crecimiento Producción de vacunas v Antihepatitis B

IMPORTANCIA BIOMÉDICA · Diagnóstico de enfermedades genéticas con cambios en la secuencia de ADN (base molecular de la enfermedad) • Hipercolesterolemia familiar • Drepanocitosis • Talasemias • Fibrosis Quística • Distrofia Muscular

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN ³ Forma (doble hélice de nucleótidos) Componentes (bases nitrogenadas, azúcares, enlaces ³ fosfodiéster) Apareamiento de las bases (A: T, G: C) ³ Pares de bases en genoma haploide humano (3 x 109) ³ Longitud de genes (3 x 103) ³ Empacamiento del ADN (histonas) ³

ESTRUCTURA MOLECULAR DEL ADN

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN ¬ Replicación ¬ Transcripción (Exones e intrones) ¬ Traducción ¬ Síntesis de proteínas

EXPRESIÓN GENÉTICA DEL ADN

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Aislamiento del ADN ð Desnaturalización ð Manipulación ð Endonucleasas Polimerasas Formación de moléculas quiméricas ð

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: endonucleasas Endonucleasas: í enzimas que cortan enlaces fosfodiéster del material genético a partir í de una secuencia de nucleótidos que reconocen (diana de restricción ) ; estos tienen entre 4 y 12 pb. Cortan ADN de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (se leen igual en ambas direcciones). Esto produce dos extremos: romos y cohesivos o escalonados, unidos por ligasas. Arber, Nathans y Smith, 1978, Nobel de Medicina. E. coli. Insulina í humana.

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE: endonucleasas Organismos procarióticos (bacterias) í Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. í No pueden cortar ADN metilado. Isoesquizómeros: í de diferentes especies í idéntica diana ídejan el mismo extremo cohesivo pero no cortan en el mismo sitio.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Las enzimas de restricción al cortar el ADN pueden producir 2 tipos de cortes: 1. Cohesivos o pegajosos: GAATTC GGATCC AAGCTT CTTAAG CCTAGG AACGAA Eco. RI Bam. HI Hind. III 2. Abruptos: AATATT CCCGGG TTATAA GGGCCC Ssp. I Sma. I

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: endonucleasas Tipo 1: Restricción (cortan) y modificación (metilan). o cortan al azar en sitios distinto (corriente arriba o abajo) o dejan extremos cohesivos o Necesitan ATP o Necesitan de S adenosil metionina (SAM) y Mg+2 como cofactores. Tipo 2: Sólo restricción. o otras enzimas metilan. o cortan de manera consistente y predecible en el sitio que reconocen o muy cerca de él. o son muy utilizadas en clonación (recuperan secuencias conocidas) o sólo requieren Mg+2 como cofactor. o no necesitan ATP. Tipo 3: Enzima oligomérica (realizan todas las actividades) o cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio restrictivo, dejando extremos cohesivos. o requieren dos secuencias de reconocimiento de orientación opuesta en la misma cadena de ADN. o Necesitan ATP, Mg y SAM.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Nomenclatura El nombre se asigna según el origen bacteriano. Consiste en: 1)Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo: Escherichia coli (Eco) 2) La cepa o estirpe si la hubiere. ( Eco. R, aislada de la cepa RY 13 de E. coli ) 3) En números romanos para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de una misma especie. No confundir con el tipo o clase de enzima. 4) Todas deberían llevar delante una R de restricción o M de metilasa según la función pero usualmente se omite.

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE: vectores Definición Vectores Plásmidos bacterianos ADN circular de doble banda Inserción de 6 -10 Kb Fagos virales ADN lineal de doble banda inserción de 10 -20 Kb Cósmidos Son plásmidos con características de fagos ADN circular de doble banda inserción de 35 -60 Kb YAC Son cromosomas artificiales de levaduras

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE Propiedades de los vectores Replicaciones independientes del ADN de la célula hospedera v Secuencias de ADN conocidas v Copias únicas v Cromosoma más pequeño que el del hospedero v

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

CLONACIÓN Definición: 1. m. Biol. Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originado por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales. 2. m. Biol. Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original.

CLONACIÓN

Gracias