ACTIVIDAD ANTIHIPERTENSIVA Y ANTIOXIDANTE EN PPTIDOS DERIVADOS DE

ACTIVIDAD ANTIHIPERTENSIVA Y ANTIOXIDANTE EN PÉPTIDOS DERIVADOS DE PROTEÍNAS ALIMENTARIAS Dra. Marta Miguel Castro

HIPERTENSIÓN ARTERIAL Es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular 2013 - La OMS calculó que en 2030 morirán 23, 3 millones de personas por enfermedad cardiovascular. 14 millones de hipertensos 40% de la población general adulta - 68% en personas > 60 años Fácil diagnóstico Tratamiento regular de por vida Existen fármacos eficaces 2

Introducción TRATAMIENTO HIPERTENSIÓN ARTERIAL Dieta saludable Ejercicio físico Tratamiento farmacológico Restricción de sal Regular Terapia individualizada alcohol y cafeína Moderado Pocos pacientes controlados 3 NUEVOS ABORDAJES

Fermentación Hidrólisis Proteína original inactiva 4 Péptidos bioactivos

OBTENCIÓN DE PÉPTIDOS PROTEÍNA NATIVA AU 214 nm - 0. 8 0. 7 0. 6 0. 5 0. 4 0. 3 0. 2 0. 1 0. 0 -0. 1 INCUBACIÓN CON ENZIMAS HIDROLIZADO 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 Tiempo de retención (min) ULTRAFILTRACIÓN SUBFRACCIONES IC 50 (ng/ml) ACTIVIDAD IECA Y/O ANTIOXIDANTE in vitro PERMEADO 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ACTIVIDAD IECA Y/O ANTIOXIDANTE in vitro F 6 F 7 F 8 RP-HPLCMS/MS ESI-MS/MS FRACCIONAMIENTO RP-HPLC-ESI-MS/MS - ESI- MS/MS F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6 F 7 F 8 F 9 IDENTIFICACIÓN ACTIVIDAD IECA Y/O ANTIOXIDANTE in vitro SÍNTESIS PÉPTIDOS ACTIVIDAD in vivo 5 TRAMPA DE IONES DIGESTIÓN GASTROINTESTINAL ACTIVIDAD IECA Y/O ANTIOXIDANTE in vitro

SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA ANGIOTENSINÓGENO Renina Bradiquinina ANG I ECA IECA m en ANG II a Fr 6 g to s

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD IECA IN VITRO (Cushman y Cheung, 1971) Angiotensina II + His-Leu ECA Ácido Hipúrico + His-Leu Hipuril-Histidil-Leucina Evaporar el Acetato de Etilo Añadir 20 μl de ECA 95ºC 10 min. Extraer 750 μl de fase orgánica Medir Absorbancia STOP Muestra (40 l) HHL (100 l) Incubar 37 ºC 30 min. Parar la 228 nm Añadir 1 ml de Acetato de Etilo reacción con Agitar 20 s 150 μl de centrifugar 10´ 4000 rpm HCl 1 N 7 Redisolver el residuo de ácido hipúrico en 800 μl de agua

DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (ORAC) ORAC = Capacidad para absorber radicales libres de oxígeno. (Dávalos et al. 2004) MUESTRA Fluorímetro 20 µl muestra + 120 µl fluoresceina disódica + 60 µl APPH Excitación 490 nm Emisión 490/520 nm CURVA PATRÓN 20 µl Trolox + 120 µl fluoresceina disódica + 60 µl APPH CONTROL 20 µl PBS + 120 µl fluoresceina disódica + 60 µl APPH 8

RESISTENCIA DE LOS PÉPTIDOS A LAS ENZIMAS GASTROINTESTINALES Corolasa-PP Pepsina PÉPTIDO HIDROLIZADO Inactivación 95ºC, 15 min p. H 2 p. H 7, 5 Estómago 90 min Intestino delgado 150 min Identificación de fragmentos 37ºC Agitación Ensayos in vitro e in vivo 9

ESTUDIOS in vivo MODELOS EXPERIMENTALES DE HIPERTENSIÓN ● DE ORIGEN RENAL Por coartación de la arteria renal Por compresión externa del parénquima renal ● DE ORIGEN DIETÉTICO Y ENDOCRINO Sensibles a la sal: Ratas Dahl Ratas Sabra Ratas Lyon Por administración de desoxicorticosterona (DOCA) Mixtos: DOCA + Sal Por deprivación de calcio ● DE ORIGEN GENÉTICO: RATAS 10 SHR

RATAS ESPONTÁNEAMENTE HIPERTENSAS Mejor modelo experimental de hipertensión genética Aparición temprana Condicionada genética Hipertensión Paulatino de resistencias vasculares esencial humana Sensible a la ingesta de sodio, estrés, etc Modelo Experimental Referente de normalidad Rata SHR Hipertensión esencial humana Rata Wistar-Kyoto No exceso de peso corporal Alterada la función tiroidea Poco sensibles a diuréticos No aterosclerosis 11 Okamoto & Aoki. Jpn Circ J 1963; 27: 282 -293. Trippodo & Frohlich. Circ Res 1981; 48: 309 -311.

PAS (mm Hg) DESARROLLO DE LA HIPERTENSIÓN EN RATAS SHR FASE DE DESARROLLO RÁPIDO ESTABILIZACIÓN SEMANAS DE VIDA 12

MEDIDA DE LA PRESIÓN ARTERIAL Método del manguito en la cola Buñag, J Appl Physiol 1973; 34: 279 -282. MEDIDOR DE PRESIÓN CEPO MANGUITO TRANSDUCTOR 13

MEDIDA DE LA PRESIÓN ARTERIAL TELEMETRÍA IMPLANTES TELEMÉTRICOS TRANSMITEN DATOS DESDE EL ANIMAL AL RECEPTOR MEDIANTE ONDAS DE FRECUENCIA RECEPTOR TELEMÉTRICO ENVÍA DATOS A LA MATRIZ. SE SITÚA BAJO LA JAULA DEL ANIMAL ORDENADOR RECOGE Y ALMACENA LOS DATOS MEDIDOR DE PRESIÓN MATRIZ DE INTERCAMBIO DE DATOS PROCESA LA INFORMACIÓN DE HASTA 20 RECEPTORES 14

EVALUACIÓN DE UN EFECTO AGUDO SOBRE LA PRESIÓN ARTERIAL Ratas SHR de 17 -20 semanas de vida ♂ Administración intragástrica 0 horas 2 horas Medida inicial Control negativo (agua) Control positivo (fármaco) Testigo (producto estándar) Problema 1 (dosis baja) Problema 2 (dosis intermedia) Problema 3 (dosis alta) 4 horas 6 horas 8 horas 24 horas Medidas post-administración 15 48 horas

EVALUACIÓN DEL EFECTO DE UNA ADMINISTRACIÓN CRÓNICA SOBRE LA PRESIÓN ARTERIAL FIN DEL TRATAMIENTO INICIO DEL TRATAMIENTO SEMANAS DE VIDA 10 SHR grupo 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 TRATAMIENTO Control negativo (agua) Control positivo (fármaco) Testigo (producto estándar) Problema 1 (conc. baja) Problema 2 (conc. intermedia) Problema 3 (conc. alta) REVERSIÓN CONTROL SEMANAL PESO CORPORAL, INGESTA SÓLIDA E INGESTA ÍQUIDA CONTROL SEMANAL PRESIÓN ARTERIAL 20 SEMANAS SACRIFICAR 5 ANIMALES/GRUPO 16 24 SEMANAS SACRIFICAR RESTO ANIMALES ESTUDIOS EN PLASMA, VASOS Y OTROS ÓRGANOS

PRINCIPALES MECANISMOS IMPLICADOS EN EL EFECTO ANTIHIPERTENSIVO ACCIÓN VASCULAR INHIBICIÓN ECA EFECTO ANTIOXIDANTE ECA Ang I Endotelio Ang II PGI 2 O 2 NO OH● H 2 O 2 Músculo liso . 17 ONOO-

EVALUACIÓN DEL EFECTO VASCULAR BAÑOS DE ÓRGANOS TRANSDUCTOR Tensión = 2 g AMPLIFICADOR Cl. Na 118. 2 m. M Cl. K 4. 7 m. M 37 ° ORDENADOR CO 3 HNa 6. 25 m. M Cl 2 Ca 2. 5 m. M Glucosa 10 m. M p. H = 7, 3 95% CO 2 5% O 2 18 MIÓGRAFO

CAPACIDAD FUNCIONAL DEL ENDOTELIO Furchgott y Zawadzki. Nature 1980; 288: 373 -76 5 MTX - Log [M] 9 8 Ach 7 6 5 - Log [M] EFECTO ENDOTELIO DEPENDIENTE PREPARACIONES Intacta Sin endotelio Con L-NAME Con Indometacina 19 Raspado Saponina

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ECA EN EL PLASMA Angiotensina I Angiotensina II + His-Leu ECA Ácido Hipúrico + His-Leu Hipuril-Histidil-Leucina Incubar 10 min. STOP Plasma (3 l) HHL (40 l) Incubar 37 ºC 30 min. Parar reacción con 190 μl de HCl 0. 35 N Añadir 100 l de OPA al 2% en Metanol 20 Medir Fluorescencia 350 nm ex 520 nm em

PÉPTIDOS ANTIHIPERTENSIVOS DERIVADOS DE ALIMENTOS OTROS GRUPOS NOSOTROS IPP VPP LHLPLP FRADHPFL YAEERYPIL RADHPFL IVF OVOKININA RADHPF OVOKININA (2 -7) Actividad Inhibidora de la ECA 21

EFECTO AGUDO DEL PÉPTIDO YAEERYPIL EN RATAS SHR D PAS (mm Hg) Agua (a) Captopril (50 mg/kg) (b) YAEERYPIL (0, 5 mg/kg) (a) YAEERYPIL (1 mg/kg) (c) YAEERYPIL (2 mg/kg) (c) Tiempo después de la administración (horas) D PAD (mm Hg) Agua (a) Captopril (50 mg/kg) (b) YAEERYPIL (0, 5 mg/kg) (c) YAEERYPIL (1 mg/kg) (d) YAEERYPIL (2 mg/kg) (e) Tiempo después de la administración (horas) 22

ADMINISTRACIÓN CRÓNICA DE PRODUCTO LÁCTEO FERMENTADO EN RATAS SHR Leche fermentada sin actividad IECA Leche fermentada con actividad IECA + Calcio PAS (mm Hg) Agua TRATAMIENTO REVERSIÓN Semanas de vida 23 Captopril (100 mg/kg/día)

ALIMENTOS FUNCIONALES CON PÉPTIDOS ANTIHIPERTENSIVOS Producto Leche fermentada Nombre comercial Componente activo “Ámeal Peptide”a “Flora Proactive”b IPP, VPP Empresa / País Calpis Co. / Japóna Unilever / Españab Leche fermentada “Evolus”a “LH”b “Kaiku Vita”c IPP, VPP “Emmi-Evolus”d Hidrolizado de caseínas Hidrolizado de proteínas de suero Hidrolizado de proteínas de bonito Hidrolizado de proteínas de sardina Casein DP peptio drink C 12 Peption Biozate Peptide soup - FOSHU: Alimento de uso específico para la salud 24 FFVAPFEVF GK Péptidos de suero Valio Ltd. / Finlandiaa Mjòlkursamsalan / Islandiab Kaiku-Iparlat / Españac Emmi / Suiza, Portugal, Malta e Italiad Kanebo, Ltd / Japón DMV International / Holanda Davisco / EEUU LKPNM NIPPON / Japón VY Aprobado por el Gobierno Japonés como FOSHU