Acidfast Aside direnliBakteriler Do Dr Arzu FINDIK Acidfast
Acid-fast (Aside dirençli)Bakteriler Doç. Dr. Arzu FINDIK
Acid-fast? • Aside dirençlilik; bazı bakterilerin (ve daha az olarak da protozoonların)fiziksel bir özelliği olup, boyama sürecinde asitle dekolarasyona karşı dirençliliği ifade eder. • Aside dirençli organizmaları standart mikrobiyolojik tekniklerle, örn; Gram boyama ile karakterize etmek güçtür. Bununla birlikte, konsantre boyalarla ve özellikle ısıtma işlemi ile kombine edilerek boyanabilir. Birkez boyandıklarında, sulandırılmış asit ve/veya etanol bazlı dekolarasyon işlemine direnç gösterirler.
Hangi bakteriler acid-fast? • • Mycobacteria Nocardia Legionella Rhodococcus
Acid-fast bakteri hücre duvarı yapısı • Kalın, primer olarak “mikolik asit” yağ asidinden oluşmuş, lipidden zengin mumsu bir tabaka ve peptidoglikandan ibarettir. Lipid tabaka peptidoglikanın üstünde yer alır ve bu yapıya bir şeker olan arabinogalaktan da iştirak eder. • Gram boyama ile boyanamamalarına rağmen Gram pozitif kabul edilirler ancak bu sınıflandırmada yer almazlar.
Mikobakterilerin hücre duvarları • Yüksek oranda kompleks lipidler içerirler • Hücre duvarındaki kimyasal maddelerin çoğu virülans ve diğer önemli biyolojik etkilerden sorumludur – Lipoarabinomannan (LAM); arabinoz ve mannoz içeren ve fosforile olmuş bir lipopolisakkarit olup önemli virülens faktörüdür – Fenolik glikolipidler; virülens faktörü
Mikobakterilerin hücre duvarları • Peptidoglikan; s. memranın üzerinde yer alır, kısa peptid zincirleri ve çapraz bağlarla sıkıca bağlanan uzun polisakkarit zincirleri içerir • Arabinogalaktan; hücre duvarı kitlesinin yaklaşık 1/3’ini oluşturur ve peptidoglikana fosfodiester köprüleri ile bağlıdır. • Arabinogalaktanın uç arabinoz birimlerinde mikolik asit vardır • En dış tabaka; mikozidler olup bir grup heterojen peptidogliolipidler ve/veya fenolik glikolipidden oluşur.
Acid-fast bakteri hücre duvarı yapısı
Karakteristik mumsu (lipoidal) tabakanın organizmaya kazandırdıkları • Kimyasalların hücre içine girişine engel olur=Yavaş üreme • Ekstrem bir hidrofobisite • Konak defansından kaçma • Boyalara, deterjanlara ve geleneksel antibiyotiklere karşı direnç
Ziehl-Neelsen Boyama • Acid-fast boyama olarak da bilinir • İlk kez, iki Alman doktor, bakteriyolog Franz Ziehl ve patolog Friedrich Neelsen tarafından tanımlanmıştır • Bu boyamada kullanılan reaktifler – Karbol fuksin (asit fenikli bir anilin boyası) – Asit-alkol (%5 HCl + %95 etanol) – Metilen mavisi • Bu boyama metodunun bir varyasyonu mikolojide de kullanılır. Ayrıca bazı protozoonlar, özellikle Cryptosporidium ve Isospora’ların identifikasyonunda da kullanılır.
Ziehl-Neelsen Boyama • İlk boya olan karbol fuksin “lipid-soluble”-yağda çözünebilir ve fenol içerir. Bu da boyanın hücre duvarından geçmesine yardım eder. Bu geçişe ısıtma işlemi de yardımcı olur. • İkinci aşamada güçlü bir dekolorizer (asit-alkol) ile aside dirençli olmayan organizmalardan boya giderilebilirken, aside dirençli olanlar boyayı vermez. • Dekolorize olmuş non-acid-fast hücreler karşıt boya ile boyanır.
Ziehl-Neelsen Boyama Protokol • Hazırlanan smear (tüberkelden, balgamdan veya kültürden) ısı veya kimyasal tepit yöntemleri ile tespit edilir. • İlk boya olan karbol fuksin ile 4 -5 dk. süreyle –alttan ısıtılarak- boyanır. Bu sırada preparatın yanmamasına ve boyanın kaynamamasına dikkat edilir. Üzerinden buhar çıkabilir. • Preparatın biraz soğuması beklendikten sonra su ile yıkanır ve preparat asit-alkol (%5 HCl+ %95 etanol veya izopropanol alkol içinde %3 HCl) ile muamele edilir (dekolorizasyon) • Su ile yıkanır ve ikinci boya olan Metilen mavisi preparat üzerine damlatılıp yayılır. 15 -20 sn süreyle boyanır. Sonra yıkanıp kurutulur ve immersiyon objektifinde incelenir.
Mekanizma • İlk olarak, Karbol Fuksin her hücreyi boyar • Asit-alkolle boya giderildiğinde sadece aside dirençli olmayan bakteriler, kalın ve mumsu tabakaları olmadığı için boyayı verirler. • Karşıt boyama yapıldığında ise, non-acid-fast bakteriler boyanarak metilen mavisinin mavi rengini alır. • Acid-fast bakteriler kırmızı, diğerleri mavi renkte görünür.
Modifikasyonlar • Dekolarasyonda; %5 sülfürik asit, Mycobacterium leprae için kullanılırken %20 sülfürik asit Mycobacterium tuberculosis için kullanılır. • Kinyoun modifikasyonu (veya soğuk Ziehl– Neelsen tekniği) • Fuksin boya solüsyonunun içindeki toksik fenol yerine bir deterjan konularak uygulanan protokol
Kinyoun Boyama • Isıtma aşaması içermez. Diğer aşamalar Ziehl Neelsen ile aynıdır. Kinyoun karbol fuksinde fenol konsantrasyonu daha fazladır ve ısıtmaya ihtiyaç yoktur. Mikroskobik görüntü Ziehl Neelsen’deki gibidir.
Ziehl Neelsen ile boyanmış preparatta acid-fast ve non acid-fast bakteriler
• http: //www. youtube. com/watch? v=Yz. Tg. HUa. Cqo&list=PLDB 6 E 493 B 0 A 6 F 6567&index=11
- Slides: 16