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ABLS多套式聚合酶鏈反應及生物晶片 快速檢測方法之開發 邱義欣 1、蘇偉瑄1、張雅雲 1、李承隆1、楊韻潔 1、黃宇男 2、許勝傑 3、邱義欣 1、曾浩洋1、蔣育錚 1* 1弘光科技大學食品科技系 2東海大學食品科學研究所 3國立中興大學食品暨應用生物科技學系 摘 要 結 乳酸菌於發酵乳製品、肉類和蔬菜中扮演重要的角色，許多乳 圖 1. 1 ABLS之m. PCR檢測結果 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 酸菌可做為益生菌或動物飼料添加物使用。品質管制有賴可靠的方 法來鑑定益生菌與發酵產品中的乳酸菌種。因此，本研究利用 gro. ESL、tuf及dna. K等基因設計專一性引子組和探針進行重要乳酸桿 菌（AL：Lactobacillus acidophilus、L. delbrueckii subsp. bulgaricus）、 1007 bp → 雙岐桿菌（B：Bifidobacterium lactis、B. longum）與嗜熱鏈球菌（S： Streptococcus thermophilus）等之多套式聚合酶鏈反應（multiplex 367 bp或 372 bp → polymerase chain reaction；m. PCR）及生物晶片開發。結果顯示，本 161 bp → 研究所開發之ABLS m. PCR及生物晶片可有效偵測到人 添加乳酸菌 Lane M: 100 bp ladder; Lane 1: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis 與市售乳酸菌相關產品中的ABLS菌株，藉以提供一個ABLS之 (BCRC 17394); Lane 2: L. acidophilus (BCRC 10695), B. longum (BCRC 11847); Lane 3: L. acidophilus (BCRC 10695), L. Delbrueckii m. PCR與生物晶片模型，並應用於市售含ABLS菌株之乳酸菌相關產 subsp bulgaricus (BCRC 10696); Lane 4: L. acidophilus (BCRC 10695), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 5: B. lactis (BCRC 17394), B. 品之檢測，以作為產品品質控制以及衛生主管機關監控所使用。 longum (BCRC 11847), Lane 6: B. lactis (BCRC 17394), L. Delbrueckii 前 言 由於市售優酪乳琳瑯滿目，各種產品中所含的乳酸菌可能包含 了一種以上，而為了能夠同時、快速且簡單的來檢測多種不同乳酸 菌，生物晶片為解決的方法之ㄧ。因此，本研究乃利用本實驗室針 對gro. ESL、tuf及dna. K等基因設計專一性引子組和探針進行重要乳酸 桿菌（AL：Lactobacillus acidophilus、L. delbrueckii subsp. bulgaricus）、雙岐桿菌（B：Bifidobacterium lactis、B. longum）與 嗜熱鏈球菌（S：Streptococcus thermophilus）等之多套式聚合酶鏈 反應（multiplex polymerase chain reaction；m. PCR）及製作成可快速 檢測市售乳酸菌相關產品中的ABLS菌株之生物晶片。 材料與方法 果 圖 1. 2 ABLS之m. PCR檢測結果 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1007 bp → 367 bp或 372 bp → 161 bp → Lane M: 100 bp ladder; Lane 1: B. lactis (BCRC 17394), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 2: B. lactis (BCRC 17394), B. longum (BCRC 11847), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696); Lane 3: B. lactis (BCRC 17394), B. longum (BCRC 11847), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 4: L. acidophilus (BCRC 10695), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 5: L. acidophilus (BCRC 10695), B. longum (BCRC 11847), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 6: L. acidophilus (BCRC 10695), B. longum (BCRC 11847), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), Lane 7: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis (BCRC 17394), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 8: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis (BCRC 17394), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696); Lane 9: L. acidophilus (BCRC 10695) , B. lactis (BCRC 17394) , B. longum (BCRC 11847). subsp bulgaricus (BCRC 10696); Lane 7: B. lactis (BCRC 17394), S. thermophilus (BCRC 12257), Lane 8: B. longum (BCRC 11847), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696); Lane 9: B. longum (BCRC 11847), S. thermophilus (BCRC 12257), Lane 10: L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257). 圖 1. 3 ABLS之m. PCR檢測結果 圖 1. 4 ABLS之m. PCR檢測結果 M 1 2 3 4 5 M 1 2 1007 bp → 367 bp或 372 bp → 161 bp → 菌株 本研究使用的標準菌株 L. acidophilus (BCRC 14064)、 L. delbrueckii subsp. bulgaricus (BCRC 10696) 、 B. lactis (BCRC 17394) 、 B. longum (BCRC 11847) 、S. thermophilus (BCRC 12257) ，購自食品 業研究所生物資源中心 (Bioresource Collection and Research Center, BCRC, Taiwan) PCR primers 條件 本研究使用gro. ESL、tuf及dna. K等基因設計專一性引子組和探針 進行ABLS之多套式聚合酶鏈反應（multiplex polymerase chain reaction；m. PCR）將標準菌株DNA之目標基因增幅。以 94℃維持5分 鐘熱破碎，再94℃； 1 分鐘分開為單股、降溫至 51℃； 1分鐘進行引 子黏合、再升溫至 72℃； 1分鐘進行延長作用，共 35個循環，最後以 72 ℃維持7分鐘。經電泳膠體結果分別顯示出 1007 bp（L. acidophilus、 L. delbrueckii subsp. bulgaricus）、367 bp（B. lactis）、161 bp（B. longum）以及372 bp（S. thermophilus）產物。 Lane M: 100 bp ladder; Lane 1及2: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis (BCRC 17394), B. longum (BCRC 11847), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257) Lane M: 100 bp ladder; Lane 1: Bifidobacterium lactis (BCRC 17394), B. longum (BCRC 11847), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 2: L. acidophilus (BCRC 10695), B. longum (BCRC 11847), L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 3: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis (BCRC 17394) , L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 4: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis (BCRC 17394), B. longum (BCRC 11847), S. thermophilus (BCRC 12257); Lane 5: L. acidophilus (BCRC 10695), B. lactis (BCRC 17394), B. longum (BCRC 11847) , L. Delbrueckii subsp bulgaricus (BCRC 10696) 圖 2 ABLS之gro. ESL基因、tuf基因及dan. K基因設計出五組特異性探針 A 1 A 2 A 3 B 1 B 2 B 3 L. acidophilus B. lactis B. longum L. Delbrueckii subsp. bulgaricus S. thermophilus positive control 圖 3 ABLS之生物晶片結果圖 ABLS探針設計及雜交試驗 針對乳酸菌之gro. ESL基因、tuf基因及dna. K基因設計出如圖 2之5組 特異性探針將其點於生物晶片上。 L. acidophilus （A） B. lactis （B） L. Delbrueckii subsp bulgaricus （L） B. longum （B） 將25μL PCR 產物加入 200μL Hyb. Buffer 以 94℃； 5分鐘denature後， 立即冰浴 5分鐘。 L. acidophilus B. lactis B. longum S. thermophilus L. acidophilus B. lactis B. longum L. Delbrueckii subsp bulgaricus S. thermophilus （S） L. acidophilus B. longum S. thermophilus B. lactis L. Delbrueckii subsp bulgaricus S. thermophilus L. acidophilus B. lactis B. longum L. Delbrueckii subsp bulgaricus S. thermophilus 隨後，將混合液加入至晶片，於 43℃雜交反應箱內震盪反應1小時 雜交反應完畢後，屏除液體，以 200μL Wash Buffer清洗兩次（10 分鐘/次； 43℃） Wash完畢後，加入 200μL Blooking Reagent之混合液，於室溫震盪 反應30分鐘，屏除液體，再加入 200μL Streptaivdin conjugatedalkaline phosphatase之混合液，於室溫震盪反應30分鐘 Blocking反應完畢後，進行Wash步驟 Wash完畢後，隨後加入 200μL Detection Buffer潤洗。最後加入 200μL BCIL/NBT Substrate Solution進行15分鐘呈色反應，反應結果 可利用生物晶片影像讀取儀(DR. Ai. M TM Reader)判讀。 L. acidophilus B. lactis L. Delbrueckii subsp bulgaricus S. thermophilus 結 論 本研究乃利用本實驗室開發之乳酸菌gro. ESL基因、tuf 基因及dan. K基 因之特異性引子組及DNA探針，製作成可快速檢測多種含 Lactobacillus spp. 與Bifidobacterium spp. 產品之生物晶片。 參考文獻 1. 李承隆. 2009. 利用熱休克蛋白基因及區間序列設計PCR引子以區分Lactobacillus fermentum and Lactobacillus reuteri 與乳酸菌生物晶片之開發。 2. 楊韻潔. 2009. 利用熱休克蛋白基因設計Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. sakei and Bifidobacterium animalis subsp. lactis之特異性PCR引子與生物晶片及其應用。 3. 許勝傑. 2009. Tuf基因序列用於乳酸菌之分子鑑定與定量及其與16 S r. RNA基因在雙歧桿菌親緣性分析之比較.