A tuberculosis mikrobiolgiai diagnosztikja CordenKornyi Mycobakteriolgiai Referencia Laboratrium

A tuberculosis mikrobiológiai diagnosztikája Corden/Korányi Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium Dr. Szabó Nóra Mediconsult továbbképző tanfolyam A légúti infekciók klinikuma és diagnosztikai kérdései 2013 szeptember 09.

Nemzeti Mycobakteriológiai Referencia Laboratórium

Referencia Laboratórium működése Corden/Korányi n n 2009 -ben felújított, korszerű, európai szintű BSL-2 -3 szintnek megfelelő helyiségek a veszélyességi fokozatnak megfelelő munkafolyamatok szerint Légtechnika, falhűtés, zsilip rendszer, negatív nyomás, lamináris bokszok, zárt rotorú centrifugák Modern, korszerű technikai eszközök Gene. Xpert Nor. Diag Arrow Wescor HAIN A laboratórium jelenlegi diagnosztikai palettája, felszereltsége korszerű, nem marad el a fejlett európai országok ref. laboratóriumaitól (WHO : Mission report)

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TÖRTÉNETE Koch Róbert: gümőbaktérium felfedezése, 1882 Nobel-díj, 1905 Ehrlich: saválló festés Franz Ziehl és Friedrich Neelsen: saválló festés továbbfejlesztése Koch Róbert

MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS TULAJDONSÁGAI n Morfológiai sajátságok: 0, 2 -0, 5µm átm. 1, 0 -5 µm hosszú, tokkal, spórával, csillóval nem rendelkező baktérium n Gram szerint nem festhető n Sav-és alkohol álló (carbolfuxin) n Sejtfal lipidekben gazdag, hidrofób mycolsav tartalmú n Ellenálló: hónapokig életképes n Cord formáció: virulencia faktor

MYCOBACTERIUM NEMZETSÉG (>150 species) Előfordulás: talaj, természetes vizek, hálózati meleg víz Pathogenitás: OBLIGÁT OPPORTUNISTA SAPROPHYTA M. tuberculosis complex NTM M. tuberculosis M. avium M. gordonae M. bovis, M. caprae M. simiae M. terrae M. bovis BCG M. xenopi M. triviale M. africanum M. srophulaceum M. phlei M. microti M. fortuitum M. vaccae M. canetti M. chelonae M. nonchromog. M. pinnipedii M. kansasii M. flavescens

Pathogenitás Species Pathogen M. tub complex Rezervoár M. tuberculosis ember, vadak, M. bovis, M. caprae szarvasmarha M. bovis BCG, vaddisznó, borz Betegség tbc M. africanum, M. microti M. canetti, M. pinnipedii fóka M. leprae lepra Potenciálisan M. avium- talaj, madár, víz disszeminált-és pathogen M. intracellulare sertés, szarvasmarha tüdő inf. (AIDS) M. kansasii víz, szarvasmarha tüdő inf. M. marinum halak, víz bőrfekélyek M. ulcerans ember, környezet fekélyek M. abscessus- talaj, víz, állat tüdő, tályog, CF M. chelonae disszeminált

Fertőzés kialakulásának valószínűsége Inhaláció (1 -5 m átmérő) cseppinfekció Nincs fertőzés 70 -90% Fertőzés az alveoláris térben 10 -30% Látens (nyirokrendszerben) 90% Acut TB (2 éven belül) 5 -10% Infekció fellángolása -Endogén reaktiváció Megbetegedés -Exogén reinfekció Az élet során 10% Egy éven belül (HIV) 10% Egy beteg személy 10 -15 másikat képes megfertőzni egy év alatt.

WHO epidemiológiai adatok A WHO a tuberculosist húsz évvel ezelőtt világméretű fenyegetésnek nyilvánította • A világ népességének 1/3 -a gümőbaktériummal fertőzött • 8 millió új megbetegedés fordul elő évente • 1, 5 millió/év mortalitás, malária után a legmagasabb érték • A fejlődő országokban (esetek 95 %-a) a felnőttek 20 %-a TBC-ben hal meg • HIV/AIDS-ben a TBC a vezető halálok

22 high-burden countries totaling 80% of world cases Russia Cambodia Afghanistan China Pakistan Philippines Vietnam Bangladesh Brazil India Ethiopia Indonesia DR Congo Myanmar Kenya Thailand Mozambique Nigeria S. Africa Tanzania Uganda Zimbabwe Global Tuberculosis Control. WHO Report 2002. WHO/CDS/TB/2002. 295

TB burden, EUR

Az európai TBC járvány változásának okai 1974 – 1990 között az incidencia 5, 4 %/év csökkent Európában A trend megfordulásának okai: n n HIV pandémia Immigráció növekedése K-Európai országokban az Egészségügy szétrombolása Szegénység miatt marginalizálódott populáció növekedése

Trend of TB incidence in Hungary 50000 45000 40000 35000 Cases 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 1951 1956 1961 1966 1971 1976 1981 1986 1991 1996 2001 2010

A hazai tuberkulózis járványhelyzet n n n Megbetegedések száma évről évre csökken: incidencia: 1169 fő, 11 %ooo/2012 (2010 -ben már eliminációs szak) Rezisztens izolátumok száma „magas” MDR, XDR (hot spot) Nő a NTM okozta mycobacteriosisok száma (5 év alatt megduplázódott) diagnosztika fejlődése

LABORATÓRIUMI KIMUTATÁS 1. Direkt mikroszkópos: Ziehl-Neelsen Fluorochrome (auramin, rodamin) 2. Tenyésztés: Szilárd alapú Folyékony alapú 3. Identifikálás: hagyományos és mol. biol. módszerrel 4. Rezisztencia meghatározás: proporciós és mol. biol. módszerrel Molekuláris biológiai módszerek: Ø Ø Direkt kimutatás: TMA, SDA, LCR, HAIN, Gene. Xpert, Probe. Tec Identifikálás: Reverz hibridizáció, DNS szekvenálás, Maldi. Tof Rezisztencia meghatározás: Line. Probe Assay-k: Inno. Lipa, HAIN Genotipizálás: DNS fingerprint RFLP, Spoligotyping, VNTR-MIRU

1. Direkt mikroszkópos vizsgálat Ziehl-Neelsen: carbolfuchs Auramin Rodamin fluorochrom Kenet készíthető: direkt a mintából előkezelt minta üledékéből cytocentrifugált mintából Előnye: gyors (fontos közegészségügyi szempont) olcsó egyszerű kevés eszköz igény relatíve specifikus (97 % M. TBC) egyéb savállók: atipusos Mycobakterium Rhodococcus Nocardia, Gordona, Tsukamurella, Legionella micdadei Hátránya: alacsony kimutathatósági határ (103 -104 CFU/ml)

Ziehl-Neelsen pozitív pálcák

Saválló pálcák

Auramin festés

2. Tenyésztés Gold standard Előnye: specifikus érzékeny: 10 - 100 bakt/ml (80 - 85 %) identifikálni lehet rezisztencia végezhető genotipizálás, epidemiológiai kapcsolatok Hátránya: hosszú tenyésztési idő (6 - 8 hét) (generációs idő: 25 - 32 óra) A molekuláris biológiai vizsgálatok mellett is kötelezően elvégzendő!!!

2. Tenyésztés Szilárd - tojás (L J, Ogawa, Stonebrink) - agar (7 H 10, 7 H 11) - 60 -70% szenz. - 3 -8 hét Folyékony - Bactec 12 B, MGIT, MB Redox, ESP II, MB/Bac. T - 80 -90% szenz. - 3 -21 nap - több NTM, automatizált

M. tuberculosis L-J táptalajon

IDENTIFIKÁLÁS Hagyományos Növekedés sebessége Növekedés hőfoka Pigment termelés Biokémiai módszerek Obligát M. tbc compl. nem pigmentált cord képző niacin + nitrát + Molekuláris biológiai Accuprobe RFLP DNS sequenálás DNS chip Line. Probe assay-k: HAIN, Inno. Lipa Maldi-Tof Opportunista, szaprofita, NTM pigment lehet cordot ritkán képez niacin – biokémiai próbák növekedés hőfoka és sebessége

Cord formáció

Mycobakterium kimutatása direkt a mintából Nukleinsav amplifikációs technikák (NAT) Specifikus nukleinsav szakasz amplifikálása - detektálása • gyors • érzékeny ? (határ: 10 bacillus) • specifikus Fals poz. : • szennyeződés (amplikonok) • élettelen baktériumok is kimutathatók Fals neg. : • minta mennyisége kevés • DNS felszabadítása és lizise nem teljes • a mintában a bakt. eloszlása inhomogén, összecsapzódhatnak szenzitivitás specificitás Direktben poz. minta 95 % 98 % Direktben neg. minta 48 - 80 % 95 %

Molekuláris biológiai módszerek Csak légúti anyagokra vannak validálva a tesztek. Extrapulmonális anyagokkal, kezelés alatt álló betegek mintáival kevés a tapasztalat. Élő és élettelen bakt. kimutatható, ezért terápia monitorozására nem alkalmas NAT nem alkalmazható egymagában a M. TBC kimutatására, nem helyettesítheti a tenyésztést, és csak felkészült laboratóriumokban ajánlott az alkalmazásuk Gyorsaságuk miatt azonban differenciál diagnosztikailag problémás esetek kapcsán fontos és hasznos kiegészítő vizsgálatok.

MYCOBACTERIUMOK OKOZTA INFEKCIÓK DIAGNOSZTIKAI SÉMÁJA Pulmonális tbc gyanúja esetén legalább 3 egymást követő napon levett köpetminta bronchoscóppal vett minta, gyomormosó Extrapulmonális kórképek esetén megfelelő mennyiségű releváns vizsgálati anyag A minta előkezelése (koncentrálás, emésztés, dekontaminálás) NALC- Na. OH, vagy más módszer Direkt kenet vizsgálata Ziehl-Neelsen, vagy fluorochrom festéssel Pozitív: előzetes lelet Negatív Tenyésztés Szilárd táptalajon: L J, és vagy agar alapú Pozitív: identifikálás, rezisztencia meghatározás Folyékony talajon (MGIT, BACTEC) Negatív Molekuláris biológiai m. (PCR, LCR, TMA, egyéb) Pozitív: Kenet, tenyésztés L J táptalajon Eredményt össze kell vetni a tenyésztés és a kenet eredményével

Resistencia mechanizmusok 1. Csökkent sejtfal permeabilitás 2. Enzim termelés (ß-lactamase 3. Aktív pumpa rendszer 4. Génen kialakuló pontmutáció, deleció, inzerció: lépésről lépésre alakul ki, nem blockszerűen (Egyszerre többféle spontán módon létrejövő mutáció ritka, mivel egyszerre több génen kéne mutációnak kialakulni. MDR: halmozódó mutációk sorozata, amely nem spontán alakul ki, hanem emberi beavatkozás következménye • Helytelen kezelés • Nem megfelelő compliance

REZISZTENCIA VIZSGÁLÓ MÓDSZEREI Hagyományos Proporciós Kritikus koncentrációnál az érzékeny és rezisztens törzsek aránya Szilárd alapú: LJ, 7 H 10 Folyadék alapú: MGIT, Bact/Alert, Bactec 460 Molekuláris DNS strip Rezisztenciáért felelős géneken történt mutációk, deléciók és inserciók detektálása Line probe assay-k Geno. Type MTBDR, MTBDR plus Inno. Lipa Rif.

REZISZTENCIA MEGHATÁROZÁS • • • Minden újonnan izolált törzsből Ellenőrzésként legalább 4 -6 havonta (CLSI) Minden rezisztens eredményt megerősíteni a) Proporciós visgálat/ rezisztencia arány/ Szilárd táptalajon 4 -5 hét (biomassza!) Folyékony MGIT 4 -5 nap b) Rezisztenciához társuló mutációk kimutatása – RMP (rpo. B), – INH (kat. G, inh. A) Direkt a mintából Izolált törzsből

RMP REZISZTENCIA ÉS MDR TUBERKULÓZIS n A RMP monorezisztencia ritka, a RMP rezisztencia az esetek 70%ban INH rezisztenciával párosul (= MDR TB) n A RMP rezisztencia közel 100%-ban az RNS polimeráz b alegységét kódoló rpo. B gén egy igen rövid (81 bp) szakaszán található mutációkkal párosul (Telenti et al. , 1993) n Így a RMP rezisztenciát okozó mutációk gyors molekuláris detektálása a MDR TB felismeresét is jelentősen meggyorsítja és megkönnyíti

Geno. Type Mycobacteria HAIN n n MDR kimutatható Rifampicin rezisztencia rpo. B génmutáció INH rezisztencia magas fokú: kat. G gén alacsony fokú: inh. A gén Izolált törzsből Saválló pozitív beteg mintájából közvetlenül

2008 : WHO recommendations for the use of molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of MDR-TB 1) DNA Extraction 3) Hybridization Reverse hybridization of amplified nucleic acids to specific DNA probes bound on strips 2) Amplification by PCR 4) Evaluation

Reaction zones of Geno. Type® MTBDRplus (examples)

Gene. Xpert: Cepheid folyamat ábra (zárt rendszerű automata) Nucleinsav extrakciója, lysise Nucleinsav tisztítása, koncentrálása Molekulák összehozása az amplifikációs és detektáló reagenssel Puffer hozzáadása manuálisan Eldobható Cartridge minta Reakciócsőben végbemenő amplifikáció, detektálás

Xpert MTB/RIF alkalmazási területe n n Az assay (Cepheid Gene. Xpert System) semi-quantitative in-vitro diagnosztikus teszt Az Xpert MTB/RIF Assay a Mycobacterium tuberculosis complex és a rifampicin rezisztencia gyors detektálására szolgáló vizsgálat. Tuberkulózis klinikai gyanúja esetén felnőttek köpet mintájából ajánlják a teszt végzését. n Mind a direkt kenetben pozitív (sens: 98 -100 %), mind a direkt negatív (sens: 72 -91 %) esetekben javasolt a vizsgálat. n The Xpert MTB/RIF assay a kezelés monitorozására nem alkalmas n n Gyors, egyszerűen kivitelezhető, magas szenzitivitás a direkt neg. mintáknál, zárt rendszer, kereszt kontaminációra nem érzékeny, nem igényel különleges biológiai biztonsági feltételeket. Drága? * www. nejm. org Sept. 7. 2010 Boehme et colleagues PAGE | 40

Xpert MTB/RIF alkalmazása extrapulmonális mintáknál A teszt légúti mintákra van validálva Újabb vizsgálatok szerint extrapulmonális minták esetében (biopsia, genny, liquor stb) is jó a senzitivitása: 81 % és specificitása: 99, 6 % Vadwai W et al. : J. Clin. Microbiol. 2011. July 2540 -45. Ugyancsak kitűnő érzékenységet mutatott a teszt a tenyésztéshez viszonyítva vizelet 100 % széklet 100 % esetében Hillemann D. et al. . : J. Clin. Microbiol. 2011. Apr. 1202 -05.

Gyors diagnosztikai molekuláris módszerek rutinszerű alkalmazása n n n Direkt kimutatás: M. tuberculosis complex Probe. Tec Geno. Type MTBDRplus (HAIN): RMP és INH rezisztencia egyidejű meghat. légúti mintából, kezeletlen beteg mintájából Gene. Xpert-Rif: RMP rezisztencia egyidejű meghatározása Identifikálás: M. tub. compl elkülönítése, gyakori és ritka NTM azonosítása Geno. Type MTBC Geno. Type/CM, AS Rezisztencia vizsgálat I. és II. rendű szerek iránt Geno. Type MTBDR (HAIN) Geno. Type MTBDRsl Gene. Xpert-Rif Vizsgálat ideje: 1 -7 nap vs. 90 -100 nap

Izolátumok hagyományos és molekuláris vizsgálatának leletátfordulás ideje Molekuláris módszer Hagyományos módszer idő M. tbc. compl. ident. idő 1 -2 hónap HAIN MTBC M. tbc compl. id. és INH+RMP rez. 1 -2 -3 hónap HAIN MTBDR 2 -3 nap M. tbc compl. id. és II. r. szerek+ETB rez 2 -4 hónap HAIN MTBDrsl 2 -3 nap Gyakori atypusos NTM identifikálása 2 -5 hónap HAIN CM 2 -3 nap Ritka atypusos NTM identifikálása 2 -5 hónap HAIN AS 2 -3 nap M. tub. compl. ident M. bovis. M. BCG id. plus 2 -3 nap