A completamento della lezione precedente Il folding delle

A completamento della lezione precedente Il folding delle proteine 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 0

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Lezione 5 Funzione di trasporto dell’ossigeno della mioglobina e dell’emoglobina 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 2

Mioglobina e emoglobina Sono le prime proteine di cui si è caratterizzata la struttura con la cristallografia a raggi X – Facilità di separazione da altre proteine – Facilità purificazione – Alta resa Caso di studio del legame reversibile di ligandi alle proteine, a livello del loro sito attivo 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 3

Il problema del trasporto dell’ossigeno La cellula utilizza ossigeno come accettore finale di enelle reazioni di ossidazione dei substrati di crescita, essenziali per ottenere ed riusare energia (ATP) 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 4

Il gradiente di p. O 2 aria-alveoli-capillari-arterie-tessuti 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 5

Il problema del trasporto dell’ossigeno • L’ossigeno si scioglie poco in acqua: ha un basso coefficiente di solubilità (α=0, 003 ml x 100 ml-1 acqua x mm-1 Hg) • Legge di Henri dei gas (C è [O 2], vol/100 vol) • [O 2] = α P o [O 2]aq = 0, 003 x 100 mm Hg = 0, 3 ml ml-1 acqua 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 6

Il problema del trasporto dell’ossigeno • [O 2]aq = 0, 3 ml ml-1 acqua Da misure si sa che: • [O 2]sangue = 20, 4 ml ml-1 sangue Perciò [O 2]sangue = [O 2] aq + X X = 20, 4 - 0, 3 = 20, 1 = [O 2] legato = [O 2] aq / [O 2]sangue = 98, 5 % 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 7

Il problema del trasporto dell’ossigeno • Il trasporto dell’ossigeno dipende dalla formazione di un legame reversibile con le proteine del sangue • Le proteine non hanno gruppi funzionali che leghino reversibilmente l’ossigeno • Atomi metallici come ferro e reagiscono con l’ossigeno e producono specie radicaliche dell’ossigeno 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 8

Per es. Un e- si sposta dall’atomo di ferro all’ossigeno e forma un radicale 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 9

Il trasporto sicuro dell’ossigeno • Le proteine di tipo GLOBINE, si crea un ambiente anidro – gli scambi con il solvente (acqua) sono nulli • Il gruppo prostetico eme lega il ferro • Il ferro dell’eme può legare reversibilmente l’ossigeno molecolare senza fare specie radicaliche – i radicali hanno un elettrone spaiato, che può essere ceduto ad altre molecole, i cui legami si spezzano 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 10

L’eme è un tetrapirrolo ciclico 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 11

D. L. Nelson, M. M. Cox, Introduzione alla biochimica di Lehninger-Sesta edizio ne, Zanichelli editore 2018 12

D. L. Nelson, M. M. Cox, Introduzione alla biochimica di Lehninger-Sesta edizio ne, Zanichelli editore 2018 13

La famiglia delle globine • Presente in molte specie, anche nei batteri • Nell’uomo, 4 tipi: – Mioglobina, nei muscoli – Emoglobina, negli eritrociti – Neuroglobina, nei neuroni – Citoglobina, nell’endotelio vascolare 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 14

D. Nelson, M. Cox, I principi di biochimica di Lehninger-Settima edizio ne, Zanichelli editore 2018 15

D. L. Nelson, M. M. Cox, Introduzione alla biochimica di Lehninger-Sesta edizio ne, Zanichelli editore 2018 16

La caratterizzazione quantitativa del legame mioglobina-ossigeno Tutte le interazioni molecolari si possono caratterizzare quantitativamente L’ESSENZA DELLA BIOCHIMICA 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 17

L’equazione di una reazione chimica reversibile ka kd 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 18

Le costanti di velocità di reazione frazione di un reagente che si trasforma in prodotto per unità di tempo 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 19

Reazioni di primo e secondo ordine • Se il reagente è una sola molecola, la reazione è detta del primo ordine e la sua costante di velocità è k = sec-1 PL P + L reazione di dissociazione, k=kd • Se la reazione riguarda due reagenti, la reazione è detta del secondo ordine e la sua costante di velocità è k = M-1 sec-1 P + L PL 08/03/2019 - S. Passamonti reazione di associazione, k=ka 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 20

Il rapporto tra proteina legata e proteina libera è proporzionale alla concentrazione del ligando 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 21

Qual è la frazione di proteina legata? Posso calcolare Y conoscendo L, e non P? • Infatti, ho a disposizione un metodo analitico che mi consente di misurare solo L e PL (per es. O 2 e Mb. O 2 ), ma non P. • Per prima cosa uso l’algebra: vedi successiva 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 22

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Posso calcolare Y conoscendo L, e non P? Y = [L] / ([L] + 1/Ka) • Sì, ma devo conoscere il valore di Ka • E’ necessario fare delle misure, da cui ricavare Ka 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 24

La funzione iperbolica x=y/y+z • x è l’ascissa • y è l’ordinata • y tende a un valore massimo asintotico • z è il valore di x che corrisponde al 50% del valore massimo 08/03/2019 - S. Passamonti y max y 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA z x 25

IMPORTANTE Posso misurare: • Y= PL/(P+PL) • L D. L. Nelson, M. M. Cox, Introduzione alla biochimica di Lehninger-Sesta edizio ne, Zanichelli editore 2018 26

Kd = 1/Ka • Perché si usa il Kd invece del Ka ? – perché è espressa in M (come nelle condizioni sperimentali) e non M-1 per le globine L=O 2 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA O 2 si misura come p. O 2 27

Nella mioglobina Kd = P 50 = 0, 26 k. Pa = 1, 95 mm Hg Perché la mioglobina lega così fortemente l’ossigeno? • O 2 forma un forte dipolo con l’atomo di ferro e così può formare un forte legame H con l’istidina prossimale • O 2 intrappolato nel sito di legame, che aumenta di 500 volte l’affinità di O 2 per il Fe 2+ 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 28

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Le proteine non sono rigide • Piccole rotazione degli atomi intorno ai legami determinano piccole variazioni conformazionali • Si possono aprire spazi transitori per la diffusione di gas, ioni e molecole 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 30

Nelle condizioni fisiologiche, la mioglobina lega l’O 2 ma non lo rilascia, a meno che la p. O 2 nei tessuti non scenda (ischemia) 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 31

L’emoglobina • • Proteina eminica principale degli eritrociti Mr = 64. 500 Da Proteina sferica, con d=5, 5 nm Emoglobina A (Hb A) è la forma adulta: – – Eterotetramero costituito da due diverse sub-unità: α 2β 2 alfa (141 residui) e beta (146 residui) Struttura terziaria MOLTO simile alla mioglobina Struttura primaria omologhe solo per 27 residui (ca. 16%) 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 32

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La truttura quaternaria dell’emoglobina • Ogni subunità interagisce con altre due: – β 2 --α 1 --β 1 – β 2 --α 2—β 1 • Interfaccia α 1β 1 e α 2β 2 – interazioni tra 30 residui, effetto idrofobico • Interfaccia α 1β 2 e α 2β 1 – interazioni tra 19 residui 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 35

Il legame dell’ossigeno all’emoglobina causa una modificazione conformazionale • Hb ha due conformazioni – T teso • bassa affinità per O 2 – R rilassato • alta affinità per O 2 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 36

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Il legame dell’ossigeno all’eme causa la transizione T R • Il Fe 2+ nell’eme “vuoto” (deossi Hb) è leggermente asimmetrico rispetto al piano dell’eme • Il Fe 2+ nell’eme “legato” (ossi Hb) è simmetrico rispetto al piano dell’eme. • Questo spostamento del Fe causa un piccolo spostamento dell’istidina prossimale e dell’elica F dove essa si trova 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 38

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L’emoglobina è una proteina ALLOSTERICA • Dal greco: – allos = altro – stereos = forma 3 D • L’emoglobina ha due stati allosterici, T e R • Il suo modulatore allosterico è il ligando (modulatore omotropico) – Modulatori diversi dal ligando sono detti eterotropici • Le sub-unità (protomeri) non cambiano conformazione, ma la loro posizione reciproca – dovuto al riposizionamento delle coppie ioniche dell’interfaccia α 1β 2 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 40

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Il legame dell’ossigeno all’emoglobina • Hb può legare 4 molecole di O 2 • Quando la prima molecola di O 2 si lega deossi Hb (stato T) ha bassa affinità per O 2 si ha la transizione T R della prima subunità. • Questa modificazione si trasmette alle altre subunità, che assumono lo stato R anche senza legare O 2 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 43

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Il legame reversibile dell’ossigeno alla mioglobina ed emoglobina 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 45

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Fine A domani • Funzione di trasporto dell’ossigeno della mioglobina e dell’emoglobina 08/03/2019 - S. Passamonti 785 ME - INSEGNAMENTO DI BIOCHIMICA 49