96 well 1 2 3 4 5 6

96 well(一 , 二組) 1 2 3 4 5 6 7 8 P NRK CON NFk. B NRK CON CMyc NRK BMP 2 NFCk. B Myc BMP: 1 ug P NRK CON NFk. B NRK CON CMyc NRK BMP 2 NFCk. B Myc BMP: 2 ug A B C D E F G H 9 10 11 12

96 well(三 , 四組) 1 2 3 4 5 6 7 8 P NRK CON NFk. B NRK CON CMyc NRK BMP 2 NFCk. B Myc BMP: 4 ug P M 13 CON NFk. B M 13 CON CMyc M 13 BMP 2 NFCk. B Myc BMP: 1 ug A B C D E F G H 9 10 11 12

96 well(五 , 六組) 1 2 3 4 5 6 7 8 P M 13 CON NFk. B M 13 CON CMyc M 13 BMP 2 NFCk. B Myc BMP: 2 ug P M 13 CON NFk. B M 13 CON CMyc M 13 BMP 2 NFCk. B Myc BMP: 4 ug A B C D E F G H 9 10 11 12

轉殖基因表現的分析 SEAP DETECTION SYSTEM

WHY 冷光 better than 螢光 ？ LOW BACKGROUND: HIGH S/N RATIO HIGH SENSITIVITY (due to above reasons) EVEN BETTER THAN ISOTOPE Gamma-ray X-ray 冷光 螢光 可見光 偵測波長決定偵測靈敏度 靈敏

Pathway Profiling System Detection system 一. 材料 : Assay Buffer , chemiluminescent enhancer , 5 X Dilution Buffer , 25 m. M CSPD（冷光受質） Positive control placental alkaline phosphatase 二. 試驗前配置的working solution : 1. 1 X Dilution Buffer : 以 Mini-Q water 將5 X Dilution Buffer做 1: 5 稀釋 2. 1. 25 m. M CSPD Substrate working solution : 將25 m. M CSPD chemiluminescent substrate與chemiluminescent enhancer做 1: 19稀釋

三. 步驟 : 1. 將15 ml sample加到 96 -well plates的每個well裡 2. 再加入 45 ml的1 X Dilution Buffer至每個sample well中，混合均勻 3. 將step 2 的diluted sample 在 65 Oc的水浴漕裡，反應30分鐘 4. 反應30分鐘後，再將96 -well plate 放在冰上2~3分鐘回溫 5. 再加入 60 ml 的Assay buffer 至每個sample well裡，反應5分鐘 6. 再加入 60 ml的diluted CSPD Substrate 至每個sample well中，反應 10分鐘 7. 並在step 6之後的30分鐘內，以x-ray方式壓片/洗片（定影, 顯影）

Why heating 65’C 考

Why Assay buffer Rx 5 ‘ 考

使用細胞 NRK: NORMAL RAT KIDNEY (fibroblast cells) MDCK: MADIN DARBY CANINE KIDNEY (tubule) M 13: MURINE MESANGIAL CELLS

Apoptosis 組別實驗內容規劃 a. b. c. d. e. f. NRK 、NRK+植物萃取物A NRK+植物萃取物B 、 NRK+H 2 O 2 NRK+p. CMV-BMP 2 M 13 、 M 13 +BSA MDCK、MDCK+Mannitol、MDCK+H 2 O 2 M 13 +H 2 O 2

試劑置備與參數設定 staining sol’n配製： 32μl annexin V-FITC + 800 μL binding buffer + 32 μL Propidium iodine(PI) = 600μl Flow cytometer設定參數 P 1 - FSC Lin P 2 - SSC Lin P 3 – FL-1 (Annexin-V) Log P 4 – FL-2 (PI) Log

Detection of ROS

Introduction 盡可能避光

ROS DETECTION PRINCIPLE H 2 DCFDA 黃綠螢光 Intracellular Esterase Detect by Flow cytometer Oxidized by ROS

第 3組 NRK CON p. CMV-BMP 2 +DCFH CON+DCFH p. CMV-BMP 2 +DCFH BMP-2基因表現對纖維母細胞氧化壓力的影響

預期結果 (增加ROS) (不增加ROS) Control DCFH Treatment +DCFH