5 me Sminaire Atelier Formation GastroEnterologie Septembre 2006

5 ème Séminaire Atelier Formation Gastro-Enterologie Septembre 2006 Clinique Médicale Diagnostic Biologique Hépatites virales B et C Dr T. AZZI Dr K. LAYAIDA

Introduction Ø Les examens biologiques : moyen non invasif. première intention. Ø 02 types Examens : non spécifiques biochimie. spécifiques Indirects / directs. Ø Permettent l’identification du stade de l’infection virale. Ø Situations particulières : problème d’interprétation. Ø Progrès de la biologie moléculaire.

Hépatite B

structure VHB Enveloppe Capside (Core) Ag HBs Ac HBs Ag HBc Ac HBc ( foie) Ag HBe Ac HBe Génome DNA viral

Histoire naturelle Infection Incubation : 2 – 4 mois Hépatite Aigue ALAT élevée Ag HBs (+), Ig. M HBc (+) Asymptomatique 90% >90% Guérison ALAT normale Ag HBs (-), Ac HBS (+) Ac HBc (+) Ag HBe(-) AC HBe(+) <1% F. fulminante Symptomatique 10% Portage chronique Ag HBs (+) > 6 mois 5%

Sérologies et DNA

Cinétique des Marqueurs biologiques Hépatite Aigue

TABLEAU CAS DE FIGURES AIGUE Profils Stade Ag HBs(+), Ag HBe (+) Ig. M anti HBc(+) Ag HBs(-), Ac. Hbs (-) Ig. G anti-HBc(+) Ag HBs (-), Ac HBs(+), Ig. G anti-HBc(+), Infection Recente Seroconversien en cours Fenetre serologique Guérison

Cinétique des Marqueurs biologiques Hépatite Chronique Tolérance immunitaire Clairance immunitaire Réplication basse / absente Ag. HBs + Porteur inactif Ag. HBe - / anti-HBe+ Ag. HBe + ADN VHB Réactivation Séroconversion ALT Lésions (-) HCA modérée/sévère (cirrhose)

CAS DE FIGURES CHRONIQUE Profils Stades ALAT : Nl Ag HBs (+), Ag HBe (+) DNA ALAT : Ag HBs (+), Ag HBe (+) DNA ALAT : Nl Ag HBe(-) Ac HBe (+) DNA : <105 Immunotolérance Immunoélémination Portage Inactif Ou Mutant C

Situations Particulières 36 Mutants précore « pré C » ? • Prévalence en EUROPE : plus de 50%. • Absence de production Ag HBe : Ag HBe (-). • Diagnostic différentiel avec virus sauvage inactif. • Maladie fluctuante, Activité à bas bruit : - Cytolyse modérée et fluctuante - Virémie faible (104 -106 copie/ml). • Fibrose progressive et insidieuse. • Impact thérapeutique ? Résistant aux antiviraux Revue Française des Laboratoires, fevrier 2005, N ° 370

Hépatite C

SCHEMA VIRUS ET GENOTYPE Classification �� Types �� Sous-types �� Quasi-espèces (Homologie > 68%) (Homologie > 80%) (Homologie > 92%)

Histoire Naturelle Infection VHC Incubation : 2 – 4 mois Hépatite Aigue ALAT élevée Ac anti VHC (+) , ARN VHC(+) 90% 10% Asymptomatique Symptomatique Transfusion Toxicomanie AES <20% Guérison ALAT normale ARN VHC (-) Ac anti VHC(+) > 80% Infection chronique ARN VHC (+) Ac anti VHC (+)

Ac anti-VHC TESTS DE DÉPISTAGE : (ELISA 3 eme génération) Spécificité / sensibilité : 99 % / 98 % Faux Positifs : Hépatite Auto-immune. Anticorps indétectables malgré la réplication virale : immunodépression profonde hépatite aiguë C (séroconversion) Un Dépistage Positif doit être confirmé sur un second prélèvement par un second test différent du premier (Réunion de Consensus International 1999) TESTS DE VALIDATION: VALIDATION (Immunoblotting) • ELISA positive ou résultats douteux • meilleure spécificité que les tests ELISA. Gastroenterol Clin Biol 2003; 27: 718 -726

Outils diagnostic d’une infection par le VHC ET GENOTYPE SUR LA MEME PLAQUE Ac anti VHC : ELISA / Immunoblooting Ag VHC Biologie moléculaire : - test de dépistage de l’ARN - test de quantification de l’ARN Génotype : Intérêt Thérapeutique.

SEUIL DE SENSIBILITE

Cinétique des Marqueurs biologiques Hépatite Aigue Marqueurs réplication ARN VHC Ag VHC Ac anti-VHC ALAT Début infection Hépatite Aigue 20 -30% Temps

Cinétique des Marqueurs biologiques Hépatite Chronique Marqueurs réplication ARN-VHC Ag VHC Ac anti-VHC ALAT Début infection Hépatite Chronique 70 -80% Temps

Conclusion Ø Se méfier des fenêtres sérologiques; des faux négatifs; des faux positifs : ne pas hésiter à recher le génome Ø Marqueurs parfois insuffisant pour distinguer : hépatite aigue ou chronique : control biologique. Ø Pas corrélation : Biologie et Histologie : moment opportun des examens invasifs (PBF) : thérapeutique. Ø Grand apport de la biologie moléculaire.

Marqueurs Moléculaires DNA / VHB Transcription inverse Variabilité Génétique Mutations Génétiques 08 génotypes différents * Situations Particulières * Norio Akuta and al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy (2005) 55, 139– 142

Situations Particulières 36 Ø Les Variants HBs Existent ! Ø Mutants pré C Ø Même si certains tests commercialisés ont montré leur supériorité par rapport à d’autres pour certaines mutations, la vigilance est recommandée. Ø La recherche du génome du VHB est justifiée Revue Française des Laboratoires, fevrier 2005, N ° 370

Circonstances diagnostic Dépistage, Clinique Biochimie ALAT Ig. M Anti VHA Ag HBs / Anti HBc Ag HBs (+) Anti HBc(+) Infection récente VHA Ag HBs (-) Anti HBc(+) Ig. M anti-HBc (-) Infection ancienne Anti VHC (+) Infection récente VHB réactivation (+) Recherches négatives ARN du VHC non A. B. C ARN VHC VHE, CMV… non virales (+) Infection - récente - chronique (-) Guérison probable

Portage chronique virale B Ag HBe / Ac HBe ALAT DNA VHB 1 -ALAT normale 2 -Ag HBe(-) AC HBe(+) 3 - ADN <105 copie/ml Virus sauvage Portage INACTIF 1 - ALAT peu élevée 2 - Ag HBe(-) AC HBe(±) 3 - ADN =104 -106 copie/ml Virus mutant 1 -ALAT très élevée 2 -Ag HBe(+) AC HBe(-) 3 - ADN >106 copie/ml Virus sauvage Portage ACTIF

Hépatite B occulte deux études canadiennes rétrospective: sérums d’une population Inuit du lac Baker (Zhang M et al. ) une population d’hémodialysés de Winnipeg (Sun D et al. ), montrent la fréquence des infections occultes par le VHB en utilisant une technique de PCR en temps réel. Dans la population eskimo, les hépatites B occultes : 18 % ayant des marqueurs d’infection ancienne par le VHB 8 % sans aucun marqueur du VHB. Dans cette même population, la fréquence de l’hépatite B était de 4 %, et 27 % des patients avaient des marqueurs d’infection ancienne par le VHB. Cela suggère que dans les populations où la prévalence du VHB est élevée, la fréquence des hépatites B occultes l’est aussi. Il est important de noter que tous ces patients avaient un bilan hépatique normal. Dans la population d’hémodialysés la fréquence de l’hépatite B occulte était de 8 %, soit quatre à cinq fois la prévalence de l’hépatite B dans la population de Winnipeg, suggérant une éventuelle transmission nosocomiale.

Hépatite B occulte Étude rétrospective Inuit (516 patients) Ag HBs- : ADN-VHB (PCR temps réel) ADNVHB+ Groupe 1 (108) anti-HBc+ /Ac anti-HBs Groupe 2 (407) Aucun marqueur VHB ADN-VHB Sauvage Mutant pré-C Copie/ml Mixte ALAT Nle 18% 3, 38 log 10 14 % 43 % 100 % 18% 3, 40 log 10 49% 21% 30% 100 % + Étude chez 252 hémodialysés Ag HBs- : ADN VHB (PCR temps réel) Sauvage 9/252 ADN-VHB+ (3, 8 %) (2/9) 22 % 7/9 anti-HBc- Mutant pré-C Mixte ALAT Nle (3/9) 33 % (4/9) 45 % 100 % AASLD 2004 – D’après M. Zhang et al. , Winnipeg, Canada, abstract 1000 actualisé

Tests Biochimique ALAT ( SGPT) 2 cas de figure : 1. Les ALAT sont élevées Poursuite du bilan pour décision thérapeutique 2. Les ALAT sont normales, se méfier car : L’ALAT peut fluctuer. La normalité de l’ALAT s’affirme sur au moins 3 dosages consécutifs pendant 6 mois 70% des malades à ALAT normales de façon persistante ont des lésions minimes à modérées. 10% des malades présentant des ALAT normales peuvent avoir une fibrose évoluée (≥ F 2).

Les transaminases du sang, les antigènes du VHB (Ag. HBs et Ag. HBe) et les anticorps (anti HBs, anti HBc [total et Ig. M] et anti HBe) sont largement disponibles et standardisés (niveau A). L’ADN du VHB détecté par hybridation de l’ADN, avec ou sans amplification du signal; les résultats du test peuvent être exprimés qualitativement ou plus habituellement, quantitativement (niveau A). Les tests quantitatifs pour l’ADN du VHB sont limités par le manque de standardisation des différents kits disponibles et de l’unité de mesure de l’ADN du VHB (niveau A). Les différents tests ont une sensibilité différente et des gammes de linéarité différente.

Un résultat d’ADN du VHB Positif peut être retrouvé chez des individus Ag. HBs positif en utilisant la PCR qui est une technique plus sensible, ces patients ont été considérés précédemment comme porteur à l’état inactif (niveau A). L’ADN du VHB peut aussi être détecté par les techniques de PCR sensibles après une hépatite aiguë B guérie chez des individus Ag. HBs négatif qui n'ont aucun signe d'hépatite progressive (niveau B). Il y a trop peu de données pour trouver une signification clinique aux différents niveaux de l’ADN du VHB. Cependant, il semble exister un niveau au-dessous duquel l’hépatite B est inactive et non progressive, 105 copies/ml correspondent à la limite habituelle de détection avec les techniques n’utilisant pas la PCR, ces résultats sont basés sur beaucoup d'études cliniques anciennes (niveau C). Le génotype du VHB reste un outil de recherche (niveau D). Les techniques de PCR pour la recherche de l’ARN du VHD dans le sang sont des outils très sensibles pour le

TECHNIQUES DE DÉTECTION QUALITATIVE DE L’ARN DU VHC L’ARN du VHC présent en quantité trop faible pour être détecté par les méthodes d’hybridation classique. Les tests de détection qualitative de l’ARN du VHC, qui ne permettent pas de mesurer la charge virale, sont plus sensibles que les tests quantitatifs (environ 10 fois), (seuil à 50 UI/m. L). Principe de l’amplification de la cible, . Différentes méthodes utilisées : • La polymerase chain reaction (PCR) qui permet de fabriquer des copies ADN double brin : • Le TMA ( « transcription-mediated amplification » ) ou Le NASBA ( « nucleic acid sequence-based amplification » ) qui permet d fabriquer des copies ARN simple brin La technique la plus employée est la PCR: Le seuil du test le plus sensible est d l’ordre de 100 copies/m. L (50 UI/m. L). Les avantages : grande sensibilité et standardisation des tests industriels [26]. Les inconvénients : manque de reproductibilité dans les virémies faibles possibilité faux positives dues à des contaminations croisées, des faux négatifs qui imposent l’utilisation d’un contrôle interne pour chaque échantillon analysé.

MÉTHODES DE QUANTIFICATION DE L’ARN VIRAL Ou mesure de la charge virale: reflète le niveau de la réplication virale dans le foie. Deux types de techniques, peuvent être utilisées : • La technique des ADN branchés, comporte une hybridation de l’ARN viral sur un support solide, suivie d’une amplification du signal visant à obtenir un grand nombre de signaux pour chaque molécule d’ARN fixée. . Les avantages: Spécificité, très bonne reproductibilité et sa standardisation. Inconvénient majeur : une moindre sensibilité. Un seuil de détection, différents génotypes (600 UI/m. L) • La PCR quantitative : seuil en général bas ; dans le cas du VHC, il est de 600 UI/m. L. La limite : le plus souvent le défaut de linéarité pour les valeurs élevées (valeur haute détectable 500 000 UI/m. L). seuils de détection et intervalles de quantification linéaire ne peuvent être comparés rendant nécessaire une standardisation universelle de ces tests l’OMS en 1999 : définit des unités internationales (UI/m. L) Les unités deviennent de ce fait plus comparables [30]. Néanmoins, existe des variations pour certains échantillons (le standard universel étant basé sur une souche de génotype 1 a) ; il est donc recommandé de réaliser le suivi des malades avec la même technique.

QUANTIFICATION BASÉES SUR LA PCR EN TEMPS RÉEL un accroissement de la sensibilité de détection (10 copies) une extension de l’intervalle de quantification linéaire: 700 millions de copies versus 40 millions pour le DNA branché 1, 3 million pour la PCR quantitative Ces tests sont basés sur la détection simultanée, en temps réel, des brins d’ADN amplifiés lors de la PCR [31, 32]. Cette approche permet ainsi de raccourcir le temps de l’analyse qui est de 2 à 4 heures contre 6 à 12 heures pour les tests classiques. Deux systèmes sont à ce jour proposés avec des applications récemment publiées pour la quantification de l’ARN du VHC : la PCR SYBR Green sur Ligh. Cycler la PCR Taq. Man sur ABI Prism 7700 [32]. Ces études montrent une sensibilité supérieure au test de PCR quantitative classique (10 à 100 fois) et une meilleure linéarité. Ils nécessitent encore des améliorations et surtout une standardisation en unités internationales.

Différent Stades Évolutifs Diagnostic Direct Diagnostic Indirect Signes cliniques VIREMIE Contage ALAT Incubation ANTICORPS