2016 ao del Bicentenario de la Declaracin de

“ 2016 año del Bicentenario de la Declaración de la Independencia Nacional” Control de la neosporosis en un tambo comercial Lagomarsino H; Campero L; Cano D; Armendano J; Massola L; Hecker Y; García B; Gual I; Bracho V; Pardini L; Leunda M; Pereyra S; Lischinsky L; Fiorani F; Rambeaud M; Moré G; Cantón G; Unzaga J; Recalt V; Bence A; Rodríguez A; Odeón A; Venturini M; Moore D.

Introducción üProducción de leche eficiente: crecimiento, costos fijos, etc. üLos tambos pueden llegar a crecer en un 2 -3% anual. üCrecimiento afectado por causas diversas (sanitarias, etc). üLas infecciones por Neospora caninum son frecuentes. üSe desconocen los resultados de las medidas para su control ü Ausencia de tratamiento o vacunas

Neosporosis bovina en Argentina üAlta difusión de la neosporosis bovina (LAINPA, UNLP y el INTA en Anquil, Balcarce y Rafaela) üEn Argentina hay 3 aislamientos. üNC 6 - Argentina: (Basso y col. , 2001) materia fecal de un perro; ü(NC-Axis) (Basso y col. , 2014) tejidos de un cervato (Axis axis) del zoológico de La Plata. ü Como resultado este trabajo, se obtuvo el primer aislamiento de origen bovino a partir de un ternero asintomático pero congénitamente infectado, NC-Argentina LP 1 (Campero y col. , 2015).

Neospora caninum • Protozoo intracelular • Ciclo de vida heteroxeno • Vía de transmisión horizontal y vertical Speer et al. 1999 Dubey et al. 2006

Causas de aborto INTA Balcarce 1994 -2012 aprox. 1000 casos

(Pérdidas económicas anuales estimadas) U$S 46 millones Explot. Animales Riesgo de Abortos por Costo Pérdidas en riesgo de aborto por N. caninum US$/ económ. aborto N. caninum aborto estimadas Leche 1. 771. 326 8% 16, 5% 23. 382 1. 415 33. 085. 530 Carne 9. 726. 684 4, 5% 6, 7% 29. 326 440 12. 903. 440

INTERRUMPIR EL CICLO DE VIDA PARASITARIO Y LIMITAR LAS VÍAS DE TRANSMISIÓN

Causas de Rechazos en Vaq Lecheras 934 9. 040 206 22, 1% 2, 3% Infértil 345 36, 9% 3, 8% Enfermedad Sanitaria 60 6, 4% 0, 7% Patas/Manos/Aplomos 10 1, 1% 0, 1% Estado Corporal 96 10, 3% 1, 1% NC 115 12, 3% 1, 3% Endometritis 7 0, 7% 0, 1% Selección 90 9, 6% 1, 0% Otros motivos 6 0, 6% 0, 1% 100, 0% 10, 3% Aborto 65% (+) NC

Causas de Rechazos en Vacas Lecheras Baja producción Aborto Fertilidad Reducida Ubre Mastitis / RCS Enfermedad Sanitaria Fin de vida útil Patas/Manos/Aplomos Estado Corporal Carácter NC Endometritis Otros motivos 45% (+) NC 305 1026 777 488 135 169 258 265 84 13 49 46 100 3715 8, 2% 27, 6% 20, 9% 13, 1% 3, 6% 4, 5% 6, 9% 7, 1% 2, 3% 0, 3% 1, 2% 2, 7% 19. 639 1, 6% 5, 2% 4, 0% 2, 5% 0, 7% 0, 9% 1, 3% 0, 4% 0, 1% 0, 2% 0, 5% 100, 0% 18, 9%

Materiales: tambo comercial üLa seroprevalencia inicial de N. caninum era del 18, 9% y el porcentaje anual de abortos general era del 10%.

üObjetivo general Controlar las pérdidas reproductivas ocasionadas por la neosporosis bovina en un tambo comercial.

üObjetivos específicos 1) Determinar la seroprevalencia de la enfermedad y su asociación con la ocurrencia de abortos en vacas y vaquillonas 2) Caracterizar las vías de transmisión para establecer las medidas de control 3) Disminuir la seroprevalencia y los abortos mediante identificación y eliminación gradual de vacas seropositivas 4) Incrementar la producción de kilogramos de carne a partir de la utilización de semen de raza Hereford en hembras lecheras seropositivas 5) Aislar cepas de N. caninum 6) Caracterizar la dinámica de anticuerpos e inocuidad de la cepa autóctona aislada en el mismo establecimiento mediante su inoculación en hembras bovinas crónicamente infectadas

Objetivo 1: Determinar la seroprevalencia de la enfermedad y su asociación con la ocurrencia de abortos Categoría Vaca % seropositivas (total) 16, 1 (2415) a Vaquillona 27, 9 (746) b Total 18, 9 (3161) a, b Letras diferentes indican diferencias con P<0, 05 üLas diluciones de los sueros comenzaron desde 1: 25 para terneros/as y vaquillonas (Venturini y col. , 1999) y 1: 100 para vacas multíparas (Rodrigues y col. , 2004).

Proporción de la ocurrencia de abortos según la categoría y su estado serológico Categoría Vaca % de abortos (Total) Seropositiva Seronegativa 14, 1 (389)Aa OR=1, 9 8, 1 (2026)Ab OR= 2, 4 Vaquillona 28, 4 (208)Ba OR=5, 1 7, 2 (538)Ab Total 19, 1 (597) 7, 9 (2564) Letras diferentes en la misma columna (A, B) y fila (ab) indican diferencias con P<0, 05

Objetivo 2: Caracterizar las vías de transmisión para establecer las medidas de control üSangre previa ingesta de calostro de 54 terneros/as üEstudio serológico longitudinal durante 15 meses con 5 extracciones de sangre cada 75 días. üLos que resultaron negativos al muestreo precalostral fueron considerados como la población en riesgo de transmisión horizontal. üSe consideró transmisión vertical a los terneros hijos de madre positiva que resultaron positivos en el muestreo pre-calostral. üComo caso de la transmisión horizontal se contabilizaron a los animales negativos precalostralmente que seroconvirtieron en alguno de los sangrados posteriores evaluados.

Caracterización de las vías de transmisión para la neosporosis bovina considerando la población en riesgo, la eficiencia de transmisión y proporción de animales infectados Vía de transmisión Vertical Horizontal Población en riesgo 16, 6% (9/54) a 83, 3% (45/54) b Eficiencia 77, 8% (7/9) a 13, 3% (6/45) b Probabilidad (IC 95%) 77, 8% (42, 1 – 94, 4) a Proporción de an. infectados 53, 9% (7/13) a 13, 3% (6, 1 – 26, 7) b 46, 2% (6/13) a a, b Letras diferentes en la misma fila indican diferencias con P<0, 05

Objetivo 3: Disminuir la seroprevalencia y los abortos mediante identificación y eliminación gradual de vacas seropositivas ü“ 2 eventos” como criterio para la eliminación de las vacas multíparas (seropositividad a N. caninum + aborto; mastitis, lesiones podales, baja producción, pérdida de estado corporal). üLas vacas o vaquillonas seropositivas fueron inseminadas artificialmente con semen de raza Hereford. Las crías hijas de hembras seropositivas no ingresan al sistema de producción de leche y son destinadas a producción de carne.

Evolución de la seroprevalencia a N. caninum durante 5 años en vacas y vaquillonas

Porcentaje de abortos general durante 5 años en vacas y vaquillonas

Porcentaje de abortos en animales seronegativos a N. caninum durante 5 años

Número de abortos en animales seropositivos a N. caninum durante 5 años. Observar el bajo número de vaquillonas seropositivas y el bajo número de abortos en los años 2014 y 2015

Objetivo 4: Incrementar la productividad de carne mediante utilización de semen de bovinos para carne en hembras productoras de leche seropositivas a N. caninum Sexo y Raza Cab Kg PV Total kg $/kg Promedio/Cab Diferencia en % de Cruza HF vs Lch kg PV Vendido $/Kg PV Vendido Nov lechero 336 338, 3 113. 681 19, 7 - - Nov cruza HF 65 354, 5 23. 042 23, 9 4, 6% 18% Vaq cruza HF 38 340, 8 12. 950 22, 4 0, 7% 12%

Objetivo 5: Aislar cepas de N. caninum Muestreo: Sangrado de 47 pares: madre- ternero precalostral Inmunofluorescencia indirecta (IFI) Selección de 5 terneros con los títulos más altos a N. caninum Sacrificio de terneros para aislamiento de N. caninum SNC üAislamiento üPCR üHP üIHQ üAnálisis de microsatélites

Materiales y Métodos Procesamiento de SNC ü Los 5 SNC se procesaron individualmente ü Digestión con tripsina al 0, 5% ü Antibiótico-antimicótico al 2% üResuspendido en 5 m. L de solución fisiológica Inoculación en ratones interferón gamma knock out (GKO) • Ventajas de usar ratones GKO: üGenéticamente modificados para no producir interferón gamma üInterferón gamma (Th 1) ayuda a controla la infección por N. canimum ü Facilita la replicación de N. caninum

Por cada SNC de ternero se inocularon 4 ratones (total: 20 ratones) 26 dpi 27 dpi Sangrado Sacrificio de ratones IFI para N. caninum Extracción de órganos para: üAislamiento üPCR ü HP üIHQ üAnálisis de microsatélites

Mantenimiento in vivo Inoculación subcutánea con SNC de ratón enfermo (0, 5 m. L)

Mantenimiento in vitro Infección de células VERO con lavado peritoneal con taquizoítos de ratones infectados

Resultados 1/20 ratones positivo (R 1) a N. caninum por IFI R 1 §Muere 27 d. p. i. § Inoculado con ternero con título IFI: 1/5120 § IFI de R 1: 1/400 § Cerebro de R 1 se pasó a dos ratones: R 2 y R 3 R 4 § 35 d. p. i. se enfermaron y fueron sacrificados §Pool de cerebros e inoculado en R 4 § 41 d. p. i. enferma § Liq. intraperitoneal: 0, 5 x 106 taquizoítos Taquizoítos en cultivo celular 4 d. p. i.

Cluster de taquizoítos en miocardio de ratón Terneros sacrificados PCR: Positiva en SNC Histopatología: *Meningoencefalitis *Epicarditis IHQ: Negativa Ratones infectados PCR: Positiva en todos los órganos muestreados Histopatología: lesiones compatibles con N. caninum IHQ: Positiva en cerebro, corazón, pulmón e hígado 1: marcador peso molecular 2: control extracción 3: control positivo 4: control negativo 5 -12: órganos de ratones

Objetivo 6 Caracterizar la dinámica de anticuerpos e inocuidad luego de inocular la cepa autóctona aislada en el mismo establecimiento en animales crónicamente infectados üNC-Argentina LP 1 üTransporte al establecimiento luego de 48 hs de inoculada la monocapa de células. üConcentración: 1× 107 protozoos/ml en un volumen final de 2 ml. üEl inóculo fue transportado a en conservadora a 8°C hasta el momento de la inoculación la cual se realizó a los 45 minutos posteriores a la cosecha de los protozoos (Hecker y col. , 2013). üGrupos experimentales: 15 vacas recibieron placebo; 18 vacas recibieron la vacuna experimental. Asimismo 12 vaquillonas fueron inoculadas con un placebo y 13 vaquillonas recibieron el inmunógeno experimental. üLos animales fueron inoculados por vía subcutánea 21 -30 previo al inicio del servicio.

Cinética de anticuerpos en vacas seropostivas a N. caninum luego de la inoculación de una cepa autóctona del establecimiento.

Cinética de anticuerpos en vaquillonas seropostivas a N. caninum luego de la inoculación de una cepa autóctona del establecimiento.

Conclusiones ü Diagnóstico adecuado: es la neosporosis un problema en mi tambo? üTransmisión vertical versus horizontal ü Se logró disminuir significativamente la seroprevalencia de neosporosis y los abortos en vaquillonas mediante identificación y eliminación gradual de animales seropositivos ü La implementación de la IA con semen de raza para carne es una herramienta interesante para aquellos establecimientos lecheros que tengan la posibilidad de recriarlos y engordarlos-

Conclusiones üSe logró establecer un protocolo exitoso para aislar una nueva cepa de N. caninum desde un ternero asintomático, la cual podrá ser caracterizada y eventualmente utilizada en nuevas pruebas diagnósticas o inmunógenos experimentales; ü La nueva cepa (NC Argentina LP-1) fue utilizada como autovacuna en el mismo establecimiento donde fue aislada. Si bien sólo se ha podido caracterizar la dinámica de anticuerpos e inocuidad, se prevé evaluar su efecto de protección para la transmisión vertical y el aborto.

Conclusiones üLas herramientas de control integrales presentadas en este trabajo, ponen en manifiesto la importancia que tiene un acercamiento más holístico para poder prevenir estas pérdidas en sistemas de producción intensivos donde hay tantos aspectos externos que pueden llegar a influenciar negativamente la sanidad y economía del productor tambero de Argentina

Gracias por su atención AGRADECIMIENTOS Grupo del Lab. Inmunoparasitología Grupo del Sanidad Animal del INTA Balcarce Grupo de Friedrich-Loeffler-Institute Propietarios y veterinarios del establecimiento ganadero

Horacio por falta de comunicación u omisión, NO dimos precisión acerca de que las vaquillonas seropositivas no entraban. IAa C/IAsemen a partir de 2015…. ? ? ? Eso solo fue para AS? HF