2014 Prof dr sc Dario Faj Mikroskop Mikroskopija

2014 Prof. dr. sc. Dario Faj

Mikroskop

Mikroskopija u Osnovna zadaća – stvaranje slike s povećanom rezolucijom (razlučivanjem) u Razlučivanje – mogućnost razlikovanja detalja u Snaga razlučivanja (RP) – najmanja udaljenost dva detalja u objektu koji se mogu razlikovati

Rezolucija oka Vidni kut zatvaraju svjetlosne zrake koje s krajeva predmeta dolaze u oko i stvaraju sliku u Razlučivanje određeno vidnim kutom u Može se izračunati RP ≈ 50 µm na DJV u Sferne i kromatične aberacije smanjuju snagu rezolucije ≈ 100 µm na DJV u

Optički instrumenti - Lupa u Povećavamo vidni kut promatranja

Optički instrumenti - mikroskop objektiv daje realnu uvećanu sliku i određuje rezoluciju mikroskopa u okular djeluje kao lupa i stvara virtualnu sliku na 25 cm od oka u u kutno povećanje mikroskopa

Ograničenje razlučenja – pinhole camera Udaljavamo film => beskonačno veliko razlučivanje? ? Problem 1: velika rupa Problem 2: svjetlost ima valna svojstva

Svjetlost – EM val Promjena brzine u sredstvu => promjena smjera Fokusirane svjetlosne zrake ne čine točku:

Valna svojstva – ogib (difrakcija)

Valna svojstva – interferencija

Interferencija Jednak put: Konstruktivna λ/2 razlika puta: Destruktivna

Mikroskop: valna optika Raspodjela svjetlosti u Ravnini slike: TOČKA? NE. Point spread function:

Slika točke u lateralnoj ravnini PSF ima središnji disk (Airy). Prvi tamni disk ima polumjer: Normalna Uvećana r=0. 61 λ/NA

Numerička apertura Otvorni kut objektiva tvore zrake koje još sudjeluju u stvaranju slike (idu rubovima leće) Veći otvorni kut objektiva: sferni valovi udaljeniji => bolje razlučivanje

Efekt numeričke aperture na sliku (PSF) Valovi koji još uvijek čine sliku su udaljeniji za veliki NA, rezultat je uža središnja slika objekta.

Uporaba imerzijskog sredstva u imerzijsko sredstvo između objektiva i preparata smanjuje otklon zraka svjetlosti iz preparata pa povećava rezoluciju

Numerička apertura

Slika točke u lateralnoj ravnini PSF ima središnji disk (Airy). Prvi tamni disk ima polumjer: Normalna Uvećana r=0. 61 λ/NA Uz, NA=1. 4 i λ=480 nm => r=225 nm RAYLEIGHOV KRITERIJ: RP=r

Kada možemo reći da se radi o dva objekta? (Rayleigh kriterij)

Nema razlike u povećanju samo NA Korisno povećanje=rezolucija oka na 25 cm/rezolucija mikroskopa= 100µm/200 nm=500

Ograničenje rezolucije, supermikroskopija vs konvenc. epifluorosc (z os prikazana bojom)

Koja struktura nas zanima?

Posebni optički mikroskopi – povećanje kontrasta u u u kvaliteta slike ovisi o rezoluciji i kontrastu (razlikovanje na temelju različitosti intenziteta propuštene svjetlosti ) biološki preparati su disperzni sistemi u vodi – kontrast je vrlo slab poboljšanje: 1. bojenje dijelova preparata (amplitudni preparat) 2. razlika optičkih putova uzrokuje razliku faza (fazni preparat) – pretvara se u razliku intenziteta 3. uzrokovani fazni pomak ogibnih snopova - različite osvjetljenosti preparata i pozadine 4. primjena fluorescencije (prirodne i izazvane) - konfokalni mikroskop

Interferencijski mikroskop not 1 l 0 2 l u broj valova na putu L je različit u otapalu i preparatu: u razlika faza izlaznih valova u tu razliku faza pretvaramo u razliku intenziteta - interferencija valova koji prolaze kroz preparat i onih koji prolaze oko njega 1 npr l’ L 2

Primjer: Detalj s većim indeksom loma od okoline Oko ne vidi razliku u fazi.

Izvedba interferencijskog mikroskopa snop koji ne prolazi kroz preparat snop kroz preparat

jajašca i spermiji morske alge snimljeni interferencijskim mikroskopom

Fazno-kontrastni mikroskop u fazni prsten u ogibni maksm. objektiv u uzorak u kondenzor konični snop zraka ogiba se na preparatu i na leći fazna pločica u stražnjoj žarišnoj ravnini objektiva pomiče razliku faza 0 -tog i ostalih ogibnih maksimuma s l/4 na l/2 zbog destruktivne interferencije slika preparata je tamna strukture unutar preparata zbog dodatne razlike faza dobro se uočavaju

Mikroorganizmi snimljeni fazno- kontrastnim mikroskopom u bakterije u protozoe

Usporedba kontrasta za ‘klasični’ i fazno kontrastni mikroskop

Mikroskopi koji koriste fluoroscenciju • Jedna od najbrže rastućih metoda • Koriste svjetlost proizvedenu u uzorku • Vrlo osjetljivi (50 fluoroscentnih molekula po mikronu) • Puno out-of-fokus svijetlosti Jablonski dijagram fluoros

GFP (green fluorescent protein) se vezuje na receptore za glukagon Jezgre bubrežnih stanica embrija plava boja se vezala na DNA hepatokarcinoma stanice endosomi (crveno), GFP-receptor (zeleno) nakon tretmana bubrežnih stanica, receptor iz membrane migrira u citoplazmu snimila Lada Krilov

Konfokalni fluorescentni mikroskop (pretraživački; laserski snop) u u u laserski snop se fokusira na malo područje uzorak je fluorescentan reflektirana i fluorescentna svjetlost se razdvajaju zrcalom apertura ispred detektora propušta fluorescentnu svjetlost samo iz dijela uzorka u ravnini žarišta objektiva mogućnost rekonstrukcije 3 D slike

Optički put u konfokalnom pretraživačkom fluoroscentnom mikroskopu

Detektor (fotomultiplikator) Mora biti brz (konfokalni snop nekoliko µs za pixel)

‘Konvencionalni – konfokalni’ Zamagljena slika jer mikroskop ‘vidi’ svjetlost koja dolazi iz ravnine fokusa, ali i onu koja ne dolazi iz te ravnine Blokira svjetlost koja ne dolazi iz ravnine fokusa – omogućuje 3 D rekonstrukciju

bubrežne stanice embrija tretirane glukagonom (glukagonski receptor fluorescira zeleno) snimila Lada Krilov

Nedostatci konfokalnog mikroskopa u Loša efikasnost prikupljanja svijetla (fotomultiplikator je brz, ali prikupi oko 25% fotona i pretvori u elektron) u Spor – snima točku po točku (1µs za točku - 1 Mpixel? ≈ 1 s) – Teško je snimati funkcionalnost ako se nešto događa brzo RJEŠENJE: Koristiti više apertura i detektora

Spinning disc confocal Koristi puno apertura odjednom => toliko je brz da se može koristiti CCD kao detektor

Kada koristiti konfokalni mikroskop? u Fiksirani uzorci: – Tanki uzorci – ‘konvencionalni mikroskop’ – Uzorci debljine do 100 µm – konfokalni – Preko 100 µm, previše out-of-fokus svjetlosti => specijalizirani mikroskopi (npr. dvofotonski) u Živi uzorci – Dodatno voditi računa o preživljenju uzorka tijekom obasjavanja laserom

Elektronski mikroskop u Rayleighov kriterij – glavno ograničenje svjetlosne mikroskopije u r=0. 61 λ/NA u Jedino rješenje smanjiti valnu duljinu u => x-zrake? u De Brogli, valna svojstva elektrona (λ=h/mv) ubrzanih u električnom polju: u Ek=(mv 2)/2 = e U

Elektronski mikroskop Heisenbergova relacija neodređenosti?

Izvedba TEM mikroskopa top uzorak magnetske leće elektroni slika kamera vakuum -Snop iz katode -Ubrzanje do cca 100 k. V -Vakuum -Leće – magnetska polja koja usmjeravaju elektrone -U stvaranju slike sudjeluju elektroni raspršeni na atomima -Raspršenje na težim atomima veće (bolji kontrast) – biološki materijali imaju mali kontrast -Priprema preparata: zamrznut, reže se na tanke slojeve ( do 100 nm) da ne dođe do apsorpcije elektrona, bojanje teškim atoma radi boljeg kontrasta, radi osiguranja mehaničke stabilnosti preparat se smješta na nosač (srebrna mrežica)

Nosač preparata

TEM – presjek stanice

Tanki uzorak alge obojan teškim metalima (Ur, Pb)

Tanki nanokristal silicija EM Stanica pod EM Biološki materijal: vakuum, loš kontrast, osjetljiv na zračenje

Može i brzo zamrzavanje (uzorak hidratiziran)

Prikupljanje i analiza TEM slika • Samo 2 D slike • Za biološke uzorke malo elektrona na površini • Usrednjavanje niza slika iste projekcije • 3 D (CT)

Pretraživački elektronski mikroskop - SEM u top u leće uzorak detektor lošija rezolucija, dmin= 5 -10 nm, usporediva s dimenzijom upadnog elektronskog snopa 3 D kvaliteta slike dobiva se upotrebom struje sekundarnih elektrona kojom moduliramo ‘osvjetljenost’ slike plankton pumpa

SEM

“Scanning tunneling” mikroskop (STM) Prikazuje se morfologija površine uzorka u Izvor elektrona je mikrovršak pod naponom od nekoliko V u Piramida wolframovih atoma u Tunel efekt – struja tunelirajućih elektrona proporcionalna s udaljenošću vrška od površine uzorka. u Konzola vrlo osjetljiva na pokret šiljka u

“Scanning tunneling” mikroskop (STM) u u u kad je proba vrlo blizu površine javlja se struja tuneliranja, It koja se detektira varijacijom položaja probe tako da se It održava konstantna, dobiva se reljef površine - vizualizacija pojedinačnih atoma potreban je vodljiv uzorak – ograničena biološka primjena na uzorke koji se mogu obložiti ugljikom ili platinom

“Atomic force” mikroskop (AFM) u u između vrha probe i uzorka djeluju privlačne Van der Waalsove sile koje primiču konzolu uzorku na velikoj blizini, odbojne sile savijaju konzolu unatrag registracija - preko reflektiranih laserskih snopova koji padaju na niz fotoćelija mjerenje sile vezivanja, na pr. ligand-receptor

SEM TEM Neuroni Stanične organele

Elektronski mikroskop u Elektronski mikroskop popunjava prazninu od 1 µm (optički mikroskop) do 1 nm (rendgenska difrakcija)