2 Le zebrafish poisson zbre Temps de gnration

2) Le zebrafish (poisson zèbre) - Temps de génération : 3 mois - 50 à 300 embryons / ponte approches génétiques (mutants et transgéniques) -Fécondation et développement externe Observations et micromanipulations aisées + « clareté » des embryons

Le génome du zebrafish - 25 chromosomes (tous autosomes ! Pas de chromosome sexuel) - environ 1, 5 Giga-bases (1, 5 109 bases) - début du séquençage en 2001; Voir publication : « The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome” Nature 2013 1, 412, 464, 843 paires de bases (Zv 9) environ 26. 206 gènes (codant pour des protéines) voir sites internet : NCBI: http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/guide/zebrafish/index. html UCSC : http: //genome. ucsc. edu/ Ensembl : http: //www. ensembl. org (annotation « automatique » ) Vega : http: //vega. sanger. ac. uk/Danio_rerio/ (annotation vérifiée) -Centre de distribution de clones (c. DNA ou g. DNA) (pour toutes les espèces) : Ima. Genes : http: //www. imagenes-bio. de/

3400 gènes dupliqués chez le zebrafish : paralogues Cause : duplication du génome durant l’évolution des téléostéens (environ 300 millions d’années) Exemple : le gène Pax 6 a Pax 6 b 26 hpf Pax 6 a exprimé dans les yeux, SNC, cerveau postérieur (HB) HB Vues latérales Pax 6 b exprimé dans les yeux, SNC et le pancréas HB 48 hpf expression différente : partage de la fonction du gène ancestral « subfonctionalisation »

Comparaison des séquences génomiques entre les gènes paralogues (et entre orthologues) Chr. 25 Chr. 7 : exon : région non transcrite conservée Lignée transgénique P 0 Pax 6: GFP

Fécondation et clivage Contact du spermatozoïde avec l’ovule au niveau du micropyle (pôle animal) activation : entrée de Ca++ Fin de la meiose, détachement du chorion, mouvements cytoplasmiques (réserves nutritives restent au pôle végétal), mitoses synchrones (15 minutes). 15 minutes Après fécondation 30 minutes Après fécondation

Clivages symétriques et synchrones mais incomplets (méroblastiques) (Microscopie electronique) 45 minutes 1 heure (1 hpf) 1: 15 hpf (Microscopie optique : stéréomicroscope)

12 ième division (3 hpf) : Mid-Blastula-Transition Distinction de 3 types cellulaires : « deep cells » : cellules profondes embryon « enveloping layer » : cellules « externes » (périderme) « Yolk Syncytial Layer » (YSL) : syncytium près de la zone marginale (dans le sac vitellin) fig 11. 5 p 329 Division des noyaux du syncytium Nombreux noyaux dans le YSL.

Mouvement d’épibolie (stades : % d’épibolie) Les cellules s’intercalent Mouvement d’épibolie

A 50 % d’épibolie : mouvement d’involution début de la gastrulation (5 hpf) La gastrulation du zebrafish (stade « germ ring » ) Vue latérale Vue du pôle animal

Formation du bouclier embryonnaire ( « shield » ) Par les mouvements de convergence ( migration des cellules vers le côté dorsal) Fig 11. 7 p 331 « shield » Vue du pôle animal

Formation de 1) l’épiblaste (ectoderme) 2) L’hypoblaste (mésoderme et endoderme) + mouvements de - Epibolie - Involution - Convergence-extension convergence vers le côté dorsal. extension de l’axe A-P

fig 11. 6 E p 330 Hypoblaste : ségrégation en - Endoderme (jaune) (sur le syncytium/sac vitelin) - Mésoderme (rouge)(en dessous de l’épiblaste) Tout le sac vitellin recouvert Fin de la gastrulation

Neurulation Somites notochorde

Stade phylotypique Coupe transversale dans un embryon de zebrafish Notochorde Somite t. digestif Voir film similarité avec les amphibiens Mouvements d’épibolie, d’involution et de convergence-extension. NB: clivage méroblastique.

Identification de mutations récessives affectant le développement (génétique « directe » ) Identification de mutants dans des gènes zygotiques + techniques d’embryologie expérimentale injection d’ARNm et de morpholinos antisens

Identification des gènes régulateurs impliqués dans la formation des feuillets par sélection de mutants affectés --> identification du gène muté --> étude de son expression dans WT et mutants) G. Z. D. M. G. Z. Déterminant G. Z. Maternel (ovocyte) Gènes zygotiques activés 1996 : identification de plus de 1000 mutants affectant le développement du zebrafish. NB: Les gènes zygotiques peuvent être déctectés par la mutagenèse et criblage de mutant F 3 … mais pas les facteurs maternels (F 4)

Exemple : identification de mutants affecté au niveau de la notochorde. Test de complémentation pour déterminer si les gènes mutés sont différents. (croisement entre mutants) Test d’épistasie : Gène A agit sur gène B (expression de B dans le mutant A , et inversément)

1) Facteurs déterminant les axes de l’embryon Axe Antéro-postérieur : Pole animal 45 m 2 h 5 h Pole végétal Antérieur 9 h 11 h 18 h postérieur Axe A-P = Axe animal-végétal (identique au xénope)

Axe Dorso-ventral : Pas de « rotation corticale dans le zygote de zebrafish … Mais … Accumulation de β-caténine dans les noyaux - uniquement du coté dorsal - dans le syncytium et quelques blastomères Blastula de xénope Fig 11. 10 p 334 Blastula de zebrafish YSL (Immunohistochimie)e

Rôle de la β-caténine -surexpression de β-caténine du coté ventral (injection d’ARNm Au stade 64 cellules : Test de gain de fonction) embryon à 2 axes (la β-caténine est suffisante pour déterminer le coté dorsal) -Mutant « ichabod » (perte de fct): pas de côté dorsal = perte d’expression de β-caténine 2 Ichabod Phénotype identique -par injection de morpholinos bloquant β-caténine 2

Expérience démontrant la présence de déterminant maternel « dorsalisant » au pôle végétal de l’ovocyte Déplacement de ce déterminant vers le côté dorsal lors des 3 premiers clivages. Phénotype Ichabod obtenu par incubation des œufs fécondés avec le nocodazole (Inh. de microtubules)

Comparaison poisson- amphibien pour l’axe Dorso-ventral Expression de boz (facteur homéodomaine, rôle // siamois) WT Ichabod ( YSL dorsal est l’équivalent du centre de Nieuwkoop)

2) Facteurs impliqués dans la formation des feuillets chez les poissons Carte de destin chez le zebrafish : Stade : 50% épibolie (pas avant ce stade) Vues latérales 1) Disposition des 3 feuillets : axes Animal-végétal 2) Similarité avec la carte de destin du xénope

Similarité des cartes de destin entre les blastula de xénope et de zebrafish Vue latérale Les mouvements cellulaires lors de la gastrulation sont similaires chez les poisson et les batraciens des mécanismes moléculaires similaires sont impliqués dans la formation des feuillets

Des facteurs maternel dans le pôle végétal déclenche la cascade régulatrice 2: 30 hpf RNase Analyse à 5 hpf (vue du pôle animal) (vue du côté latéral) Des ARNm du sac vitellin sont nécessaires pour l’induction de l’endoderme (gta 5) et du mésoderme

Isolement de mutants avec un phénotype cyclope Localisation et identification des gènes mutés … cyclops : nodal-related 2 (nrd 2) squint : nodal-related 1 (nrd 1)

Expression de squint et cyclops Squint 3 hpf 4 hpf Vues latérales Cyclops 4 hpf Vue du pôle animal Vue du côté dorsal Expression chevauchante dans la zone marginale activité redondante ?

Phénotype sauvage WT double mutant Cyclop-Squint Double mutant Cyclop-Squint : pas d’endoderme Pas de mésoderme (ectoderme) Mutant MZ One-eyed-pinehead Signal Nodal mésoderme (Squint+cyclops) endoderme

ARNm cyc + sqt (cas) Embryon très affecté Pas d’effet Masse de Pas d’effet mésendoderme Pas expression dorsal le gène Oep est requis pour l’action des facteurs Nodal Cyc + Sqt Oep endoderme et mésoderme

Voie de signalisation Nodal dans la formation du mésendoderme Page 20 solnica schmalspur Fox. H 1 Bon (Mixer) Fau (Gata 5) Cas (sox 32) Mutants présentant une perte d’endoderme (et une « cardia bifida » )

Cyclop et Squint sont nécessaires pour activer 1) les facteurs transcriptionnels « endodermiques » Expression du gène Mixer (bon) (vue latérale) (stade fin blastula) ? Nodal Bon Sox 17 endoderme Vegt. T (Xnr 1) (Mixer) ( sox 17) 2) les facteurs transcriptionnels «mésodermiques » (Vue du pôle animal) WT mutant Cyclops; Squint Expression du gène Goosecoïd (homeobox) Nodal (sqt/cyc) goosecoïd (mésoderme dorsal) --> brachyury/Notail (mésoderme)

Mutant Notail chez le zebrafish (othologue Xbra) Mutants homozygotes Expression dans WT : 5 hpf 9 hpf « wild type » mutant oep ou cyc/sqt

Phénotype de Floating head (Zf-Not) WT Mutant Mutations

Action morphogène des signaux Nodal À forte concentration ils activent des gènes « dorsaux » (goosecoïd, Not) À basse concentration ils activent des gènes du mésoderme (No tail = brachyury) Injection d’ARNm squint dans des cellules du pôle animal

Expression des facteurs Nodal Par les cellules de la zone marginale e le « YSL » (gradient) Ectoderme Mesoderme Endoderme Mésendoderme Effet morphogène sur l’induction du mésoderme - à faible Qté : activation de Notail (Brachyury) -À grand Qté: activation de Goosecoïd , Not mésoderme dorsal : notochorde et endoderme

Antagonisme entre le côté dorsal et ventral Et formation du gradient BMP Expression de Floating head (= Not) Goosecoïd Antagonistes des BMP : -Chordin (+ noggin et follistatin-L 2) : Gradient d’activité BMP dans l’axe Dorso-Ventral (début gastrulation)

Le mutant « Chordino » : type sauvage (WT) Mutant Phenotype : « ventralisé » - Notochorde atrophiée - Excès de cellules sanguines - parties antérieures tronquées - Système nerveux atrophié, … Mutation : Gène Stop Chordin Expression : Mésoderme dorsal :

Rôle des gènes BMP (mutants « dorsalisé » ) Snail house (snh, BMP 4) Swirl (swr, BMP 2 b) WT -Absence de cellules sanguines -parties postérieures tronquées -cerveau hypertrophié, … swr Fig p 77 Expression p 82 Expression : Gradient D-V de BMP Chordin BMP

Résumé des facteurs impliqués dans la gastrulation chez le zebrafish Not (Goosecoïd) No. Tail (T) Bon, Sox 17 Signaux Nodal : (Cyclop, Squint) + β-caténine Antagonistes des BMP : Chordin Gradient d’activité BMP

Similarité avec le xénope. Facteurs maternels : Vg 1, Veg. T Dishevelled Organisateur De Spemann Gradient Nodal Gradient BMP Centre de Nieuwkoop Goosecoid Xnot Chordin Follistatin Noggin Cascade similaire chez les oiseaux et mammifères

L’axe Dorso-Ventral chez les invertébrés SOG (Short-gastrulation) est l’orthologue de chordin dpp (decapentaplegic) est un facteur TGFbeta Gradient BMP = tube neural NB : -Axe D-V « inversé » chez les invertébré - hypothèse de Saint Hilaire (1822) -Injection de SOG dans une blastula de xénope (du coté ventral) formation de notochorde Mécanisme conservé durant toute l’évolution des métazoaires

Gradient BMP