2 DNA Lokalizace chromatin Replikace Mutace reparace Rekombinace

2. DNA Lokalizace + chromatin Replikace Mutace, reparace Rekombinace Souvislosti: Buněčný cyklus

2. 1 DNA v buňce: Genom: Souhrn veškeré DNA v buňce (u některých virů je genom RNA – jde o uložení dědičné informace) Prokaryota – DNA v cytoplazmě, haploidní Eukaryota – v jádře, haploidní/diploidní, semiautonomní organely Haploidní buňka – obsahuje každý gen v jedné kopii Diploidní buňka – obsahuje každý gen/chromozóm ve 2 verzích Metageneze (rodozměna): střídání haploidních a diploidních vývojových stadií (eukaryota) Doplňková DNA: plazmidy, virová DNA (= samostatná) junk DNA: "zbytečné" sekvence DNA

Mnohobuněčné organizmy Každá somatická buňka obsahuje stejnou genetickou informaci

Lidský genom: zastoupení různých typů sekvencí junk DNA: amplifikující se sekvence (= transpozóny) pseudogeny (zdegenerované sekvence) repetitivní sekvence (= mikrosatelity atp. ) Nelze ovšem říct, že tyto sekvence nemají svou úlohu. Viz různá pojetí genu.

Větší genom nemusí znamenat vyšší komplexitu

Větší genom nemusí znamenat vyšší komplexitu II

Prokaryotická DNA • • V cytoplazmě, vazba na membránu (přes Ori, viz dále) DNA vazebné proteiny Bakteriální chromozóm = 1 molekula cirkulární DNA Plazmidy – dodatková DNA (cirkulární DNA) Funkce plazmidů: antibiotikové rezistence horizontální přenos genů (genové inženýrství)

Nadšroubovicové vinutí Bakterie: Negativní nadobrátky (kruhová DNA)

Chromatin eukaryotních buněk Chromatin – komplex proteinů a DNA Histony – DNA vazebné proteiny (bazické) Nukleozóm – histonový oktamer (H 2 A, H 2 B, H 3, H 4) + H 1 Struktura "solenoidu" Solenoid

Chromozóm = lineární molekula DNA + histony Euchromatin – nekondenzovaný (v interfázi) Heterochromatin - kondenzovaný Centromera – důležitá pro dělení jádra Telomera – důležitá pro replikaci Nobelova cena 2009 telomere Metaphase chromosome

2. 2 Replikace • • • Zdvojení DNA – vznik dvou identických řetězců DNA Semikonzervativní Probíhá 1 x za buněčný cyklus (kromě oprav) Každý úsek DNA je zreplikován právě jednou Účast celé řady enzymů Zcela zásadní buněčný proces

Syntéza DNA (in vitro) 1. Templátová ss. DNA (vzor) 2. Prekurzory (deoxynukleosid-trisfosfáty) d. NTP = {d. TTP; d. ATP; d. GTP; d. CTP} 3. DNA polymeráza (prodlužování DNA řetězce) 4. Primer (komplemetární úsek DNA nebo RNA) + vhodné prostředí: iontová síla, p. H, Mg 2+ Energie: štěpení makroergní vazby d. NTP. . . p. Ap. Gp. Cp. T+ deoxyadenosin-P~P~P →. . . p. Ap. Gp. Cp. Tp. A + P~P

DNA polymeráza • • • Prodlužuje primer (cca 20 bp) (neumí syntetizovat DNA de novo) Směr syntézy DNA: 5´ konec → 3´ konec Často další enzymatické aktivity: 5´ → 3´ exonukleázová, 3´ → 5´ exonukleázová Opravná aktivita (proofreading): štěpení nesprávně vloženého nukleotidu Více podjednotek DNA Pol. A C T A G CT CT C TG C A C T T G A C T C 5´TCATGCTCGTTAGCTACTCATGCAGCTACTCATCTCGT 3´ 3´AGTACGAGCAATCGATGAGTACGTCGATGAGTAGAGCA 5´

Replikace in vivo: těžkosti Replikace v buňce je komplikovanější (!): 1) Antiparalelita vláken: DNA pol. neumí 3´→ 5´ 2) Je třeba syntetizovat primer, zkracování konců (E. ) 3) ds. DNA: je třeba řetězce oddělit 4) "Winding problem": vznik nadobrátek Řešení = složitý enzymatický aparát: ad 1) Okazakiho fragmenty: syntéza pozpátku (lagging strand) DNA ligáza: lepení fragmentů ad 2) DNA primáza: RNA primer, telomeráza ad 3) DNA helikáza, ss. DNA vazebné proteiny ad 4) Topoizomeráza (I a II): odstranění nadobrátek

Replikace in vivo: těžkosti II 1) 2) 1) Replikační vidlička 2) Telomeráza 3) Helikáza, SSB 4) Topoizomeráza 3) VIDEO 4)

Replikační vidlička DNA polymeráza DNA primáza DNA helikáza ss. DNA binding protein svorka (clamp) clamp loader DNA ligáza Bacteria Eukarya Okazaki f. délka ~ 1000 bp ~ 100 bp Rychlost syntézy ~ 500 bp/s ~ 50 bp/s VIDEO

Přesnost replikace Nízká frekvence mutací: 1) Opravná aktivita DNA pol 2) Dvouvláknový charakter DNA Krok Frekvence chyb Polymerizace 5´ → 3´ 10 -5 Proofreading 10 -2 Mismatch repair 10 -2 Celkem 10 -9 Důkaz 3´→ 5´ exonukleázové aktivity Souvislosti: Mutace + reparace

*Různé DNA polymerázy Funkce DNA polymeráz: Syntéza komplementárního vlákna Opravy DNA Replikace organel Nahrazení RNA primeru (lagging strand) Translezní syntéza Prodlužování telomer (telomeráza)

Průběh replikace genomu 1) Iniciace V místě replikačního počátku 1 x za buněčný cyklus 2) Elongace Replikace celého genomu Replikační vidlička (viz výše) 3) Terminace Ukončení replikace Replikace bakteriálního genomu Specifika: cirkulární genom, 1 replikační počátek

*Bacteria: Replikační počátek • Pouze jeden replikační počátek • Origin (Ori. C) – délka cca 258 bp: AT bohaté sekvence Repetice (vazba Dna. A) GATC místa: methylace (regenerace) IHF a FIS vazebná místa (proteiny – ohnutí DNA)

Bacteria: Iniciace replikace 1. Dna. A – iniciátor, vazba na Ori. C 2. Vazba helikázy (Dna. B) a inhibitoru 3. Uvolnění inhibitoru (Dna. C) 4. Vazba Ssb 1 – stabilizace ss. DNA úseku 5. Dosedá replikační aparát 6. Methylace nového počátku

Elongace, terminace 1. Dekatenace (topoizomeráza II) 2. Terminace: dva protisměrné terminátory 3. U virů (a plasmidů) nejsou terminátory Valivá kružnice (rolling circle), následné štěpení

Eukarya: iniciace replikace Replikační počátky na 3. chromozómu S. cerevisiae Replikační počátky jsou iniciovány 1 x v buněčném cyklu Replikační počátky jsou iniciovány v definovaném sledu

Replikace genomu u eukaryot Rozdíly od bakterií: 1. Lineární chromozómy 2. Více replikačních počátků na chromozómu 3. Komplikovanější regulace iniciace ORC (origin recognition complex), Mdm 2 -7 p (helikáza), Cdc 6 p inhibitor helikázy Iniciace Rozdíly mezi jednotlivými organismy: Origin S. cerevisiae (ARS element): 100 – 150 bp Origin H. sapiens: asi hůře definovaný (1 -4 kbp) Regulace iniciace podrobněji v tématu Buněčný cyklus

Replikace: shrnutí = Templátem řízená syntéza DNA (duplikace) • • • DNA polymeráza (primer, opravná aktivita) Replikační vidlička (+ enzymatický aparát) Leading x lagging strand (Okazakiho fragmenty) Prokaryota x eukaryota (pouze drobné rozdíly) Proces replikace probíhá 1 x za buněčný cyklus Každý úsek DNA je zreplikován právě jednou

2. 3 Mutace + reparace Mutace = změna sekvence DNA (genetické informace) (poškození vs. evoluční novinky) Většina mutací neutrálních, pak škodlivé, nejméně evolučně výhodné Rozdělení mutací Genové: substituce, inzerce, delece samesense, missense, nonsense Chromozómové: translokace, inverze inzerce, delece Genomové: změna ploidie

Příčiny mutací 1. Chyby při replikaci 2. Poškození DNA (chemické, záření) Nejčastější poškození: Depurinace (5000/lidská buňka/den, cca 10 -7) Deaminace cytosinu (100/lidská buňka/den) Dimerizace pyrimidinů (UV záření) Dvojřetězcové zlomy (ionizační záření)

Reparační mechanismy • Identifikace a oprava poškozené sekvence • Celá řada mechanismů • Výhoda dvouvláknové DNA 1) Mis-match repair 2) Fotoreaktivace 3) Base excision repair 4) Nucleotide excision repair 5) Oprava Ds. DNA zlomů 6) Nepřesná reparace – translézní syntéza DNA

2) 1) Reparační mechanismy II 3) 4)

*Reparační mechanismy III Ds. DNA zlomy: 1. Prostá ligace 2. Homologní rekombinace (konverze) vede k zachování sekvence Translézní DNA syntéza: DNA pol. III narazí na TT a odpadá Nasedá translézní DNA pol. Syntetizuje náhodnou/nenáhodou sekvenci 6) 5)

2. 4 Genetická rekombinace = Přestavba DNA (DNA rearrangement) Typy rekombinace: 1. Obecná Výměna mezi 2 homologními sekvencemi Často při meióze, tzv. crossing-over (viz Buněčný cyklus) Oprava ds. DNA zlomů u nižších organizmů 2. Místně specifická Rekombinační aparát rozeznávající specifickou sekvenci A) Konzervativní – mechanismus založený na homologiích B) Transpoziční – šíření mobilních elementů (transpozónů)

• • • Obecná (homologní) rekombinace Vzájemné párování mezi dvěma DNA úseky Vznik křížové (Hollidayovy) struktury DNA Podílí se celá řada enzymů Oprava Ds. DNA zlomů Meiotická rekombinace (crossing-over) VIDEO

Konzervativní místně specifická rekombinace Virové integrázy (např. fág λ, fág P 1 ) Specifická sekvence na obou molekulách Je obousměrná (integrace i excise) Souvislosti: Viry a jejich strategie Integrace fága λ

Transpozóny: mobilní DNA elementy Často parazitická DNA, ale i antibiotikové rezistence Barbara Mc. Clintock (1940, NC 1983) Specifická sekvence pouze na transpozónu Enzym: transposáza (integráza) U retrotranspozónů: reverzní transkriptáza Bakteriální DNA only transpozóny Souvislosti: Viry a jejich strategie

Transpozóny II DNA only cut & paste DNA only copy & paste Nonretroviral replikativní transpozice retrotranspozition Princip množení retroviral like elementů je velmi podobný retrovirovým strategiím, které budou popsány v kapitole: Viry a jejich strategie

DNA - shrnutí • • • DNA se v buňce nachází v organizované formě s proteiny DNA nese (digitálně zapsanou) genetickou informaci "Smysluplný" úsek DNA (jednotka GI) se nazývá gen Před dělením buňky se DNA zdvojí replikací Replikace: DNA polymeráza + další enzymy Poškození DNA může vést k mutacím (změně GI) Celá řada opravných mechanizmů uchovává sekvenci DNA Rekombinace je proces přestavby sekvencí DNA Existuje mnoho typů mobilních genetických elementů • Biologie DNA má velmi úzký vztah k buněčnému cyklu