2 4 Restriction Mapping of Circular Plasmid DNA

생화학 실험 (2) 4주차 Restriction Mapping of Circular Plasmid DNA and Transformation of Ligated Plasmid DNA 담당교수 : 하상준교수님 담당조교 : 최다은

4~5 주차 실험내용 Plasmid DNA 4주차 Restriction Mapping E. Coli Transformation 5주차 Mini preparation Enzyme cutting

3. Transformation On ice 20 min Heat shock 90 sec On ice 10 min

Competent Cell Competence is the ability of a cell to take up extracellular ("naked") DNA from its environment. cation은 E. coli cell membrane에 존재하는 lipid의 negatively charged phosphate와 complex를 이루어 외부DNA가 쉽게 이동할 수 있도록 돕는 다.

Procedure 1. Restriction Enzyme Digestion of Plasmid DNA 1. Microcentrifuge tube에 mapping할 DNA와 enzyme을 다음과 같이 첨가하 여 반응혼합물을 만든다. (total reaction volume : 10 ㎕) 2. Restriction endonuclease를 0. 5 ㎕ 씩 첨가하여 pipetting으로 잘 섞은 후, 살짝 spin down하고, 37℃ , 1시간 동안 incubation 한다. 3. Gel loading buffer 2㎕ 를 첨가하여 반응을 정지 시킨다.

Restriction Enzyme Digestion of Plasmid DNA 1 enzyme cut 2 enzyme cut DNA 1 μl 10 Xbuffer 1 μl 10 XBSA 1 μl 1μl Enzyme 1 0. 5 μl Enzyme 2 EP-Tube enzyme 1 Nde 1 2 Bam. H 1 3 Nde 1 + Bam. H 1 4 Nde 1+ Xho 1 5 Bam. H 1 + Xho 1 0. 5 μl d. H 2 o 6. 5 μl 6 μl Loading buffer 2 μl

2. Agarose gel electrophoresis of digested fragments 1. 1 X TAE buffer 50 ml에 agarose를 0. 8 % 되게 넣고 microwave oven에서 가 열하여 녹인다. 2. Agarose solution을 50 -60℃로 식힌 후 gel casting platform에 붓고 gel comb을 삽입하여 상온에서 굳힌다. 3. Gel이 굳으면 electrophoresis tank에 gel을 놓고 gel 표면을 간신히 덮을 정 도로 (약 1 mm정도) running buffer (1 X TAE)를 채운다. 4. Digested DNA sample을 gel에 loading하여 100 V 전압 하에서 1시간 동안 전기영동 한다. 이때 size marker 3 ㎕도 함께 loading 한다. 5. Gel을 UV-transilluminator에 올려 놓고 DNA의 band를 확인한 후 polaroid 사진을 촬영 한다. (print-out) 6. 모든 DNA fragment가 gel 상에서 움직인 거리를 재고 크기를 알고 있는 DNA size marker와 비교하여 각각의 restriction endonuclease fragment의 크기를 계산한다. 7. Restriction map을 작성한다.

Result DNA size(base pair) determination Marker(bp) 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 500 Sample No. 1 2 3 4 5 6 7 8 Cm 0. 95 1. 05 1. 2 1. 3 1. 45 1. 7 2 2. 65 3. 35 Cm 1. 1 1. 2 2. 35 1. 1 3. 25 1. 25 2. 05 logbp 4 3. 90309 3. 778151 3. 69897 3. 60206 3. 477121 3. 30103 3 2. 69897 logbp 3. 839088 3. 785307 3. 166828 3. 839088 2. 682801 3. 758417 3. 32817 bp y=-1. 8594 x + 8. 2384 x=(8. 2384 -y)/1. 8594 x=logbp y=Cm

Result Bam. H 1 0. 5 Kb 1. 3 Kb Nde 1 Xho 1 4. 8 Kb

Further Study 1. Virology Lab. Mapping 해보기. 주어진 수치들을 이용해서 각각의 Enzyme의 위치를 나타낸 그림을 그린다. 전체 size는 4361. 기준은 Hind Ⅲ로 이것은 29번에 위치한다. Hind Ⅲ -> 4361 / Hinc Ⅱ -> 3254, 1107 Hind Ⅲ/ Hinc Ⅱ -> 624, 3737 or 483, 3878 Hinc Ⅱ/ PstⅠ -> 2954, 1407 or 300, 4061 Nde Ⅰ/ PstⅠ -> 1312, 3049 * Hinc Ⅱ = two cut 2. Lac operon을 갖는 vector를 사용한 경우, lactose를 분해하는 성질을 이용한 selection 방법에 대해 알아보자. (IPTG, X-Gal의 역할)

월요일 반에서 썼던 DNA ladder입니다. Virology Lab. 3, 4조가 썼던 DNA ladder입니다. 10000 8000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 500 1, 2조가 썼던 DNA ladder입니다.