1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEAR PROGRAMA DE DOUTORADO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA Disciplina: Seminário I Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: Ph. D Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas 2

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ PROGRAMA DE DOUTORADO INTEGRADO EM ZOOTECNIA Abordagem Proteômica e a Identificação de Biomarcadores de Processos Fisiológicos Doutorando: Rodrigo Vasconcelos de Oliveira Orientador: Ph. D Arlindo de Alencar Araripe Moura Professor: Dr. Ednardo Rodrigues Freitas 3

INTRODUÇÃO Estrutural Seres vivos Enzimática Transporte Hormonal Proteínas Imunológica 4

INTRODUÇÃO Anderson & Anderson (1982) ATLAS DAS PROTEÍNAS HUMANAS 5

Proteômica ou Proteoma (Wasinger et al. 1995) A identificação e caracterização de proteínas, constituintes de uma matriz biológica (organismo, célula, organela, fluído biológico) que são produzidas em um determinado momento e sob determinadas condições. 6

Dinâmica do proteoma Fatores epigenéticos Temperatura Estresse Doenças Alimentação WITZMANN & LI (2002) Transcrição DNA Splicing pré-RNAm Modificações Tradução Proteínas Degradações 7

OBJETIVOS DO ESTUDO DA PROTEÔMICA Nível de expressão de proteínas Modificações Póstraducionais Proteômica Interações entre proteínas Identificação de Biomarcadores 8

BIOMARCADORES São moléculas biológicas indicadoras de estados fisiológicos ou patológicos, passíveis de serem mensuradas em células e fluídos biológicos. Moore et al. , (2007) 9

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Coleta Amostra Separação Identificação ZHOU et al. , (2005) 10

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES • Coleta de amostras: – Unicelulares (+ sincronização): • fase do ciclo celular e condições de cultivo – Células e Tecidos de Organismos Pluricelulares (- sincronização): • Biópsias: ≠ tipos celulares • Cultura de tecidos – Coleta: Manual X microdissecção a laser – Fluídos biológicos • Complexidade 11

ABORDAGEM PROTEÔMICA E A IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES • Eletroforese Bidimensional (2 D) Espectrometria de Massa (EM) – Estudos fisiológicos ou patológicos comparativos; • Quantitativos • Qualitativos • Cromatografia líquida (CL) Espectrometria de massa (EM) – Recuperação de ptns na forma nativa • Análises funcionais, estruturais e bioquímicas 12

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL • Separação de misturas proteícas com base em dois parâmetros físico-químicos: ponto isoelétrico (p. I) e a massa molecular (M. M. ), sob a influência de um campo elétrico: – 1ª Etapa: Focalização Isoelétrica • p. I – 2ª Etapa: Eletroforese descontínua em gel de poliacrilamida + SDS (SDS-PAGE) • Tamanho (massa molecular) O’Farrell, 1975; Gorg et al. 1998 13

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (+) (maior) M. M. p. I (menor) (-) Focalização Isoelétrica SDS-PAGE 14

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (maior) M. M. (menor) SDS-PAGE 15

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (-) (+) p. I (+) Revelação • Azul brilhante de Coomassie coloidal • Fluorescência M. M. Análise do gel (-) 16

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL Gel A controle ≠ Gel B Tratamento ISSAQ & VEENSTRA (2008) 17

ELETROFORESE DE FLUORESCÊNCIA DIFERENCIAL EM GEL 2 D (DIGE) Cy 5 controle Cy 5 Tratamento UNLU et al. , (1997); ISSAQ & VEENSTRA (2008) 18

Tabela 1. Vantagens e limitações da eletroforese bidimensional. Vantagens Limitações Quantificar expressão Reprodutibilidade Analisar modificações póstraducionais Tempo de execução Não é automatizada Avaliar várias proteínas Proteínas de membrana Proteínas: p. I e MM extremas 19

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL E ESPECTROMETRIA DE MASSA Digestão: tripsina Espectrômetro de massas m/z Espectros de massas Programas: identificar a proteína 20

ESPECTROMETRIA DE MASSAS Técnica analítica que identifica a composição química de compostos, pela determinação de suas massas moleculares na forma iônica, baseada na sua movimentação (m/z) através de um campo elétrico ou magnético. Amostra Fonte de Ionização Analisador Detector Dados Recipiente com baixa pressão 21

ESPECTROMETRIA DE MASSA • Ionização por dessorção a laser assistida por matriz -Tempo de vôo (MALDI-TOF) Tempo de vôo Detector amostra La s er Karas & Hillkamp (1998) 22

ESPECTROMETRIA DE MASSA m/z Espectrômetro de massa Espectros de massas peptídeos Impressão Digital de peptídeos Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Proteína Biomarcador 23

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Método de separação física baseado na migração diferencial de compostos, devido a suas distintas interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel (bombeada sob pressão) e a fase estacionária (pequenas partículas). peptídeos 24

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE • Fase líquida: • Solvente: alto grau de pureza • Fase estacionária: Exclusão molecular Poros com tamanhos controlados Troca iônica Altamente carregada (íons + ou -) MATT et al. 2008 25

SISTEMA DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE Detector Bomba de alta pressão amostra Reservatório fase móvel coletor Registro e análise 26 dos dados

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA PERFORMANCE • Métodos de detecção: – Absorbância (UV) – Fluorescência – Espectrometria de massa • CL EM proteínas 27

CROMATOGRAFIA ASSOCIADA A ESPECTROMETRIA DE MASSA EM TANDEM (ES/ES) • Ionização por spray de elétrons –Tempo de vôo em TANDEM (ESI-TOF/TOF) Camara de colisão m/z MATT et al. , 2008 28

ESPECTROMETRIA DE MASSA (EM/EM) Espectrômetro de massa (EM/EM) m/z Espectros de massas Sequenciamento de novo da proteína Programas de Análise e pesquisa em banco de dados. Proteína Biomarcador 29

Tabela 1. Vantagens e limitações da cromatografia líquida de alta performance. Vantagens Limitações Tempo de execução Custo do equipamento Automatização Manutenção do equipamento Versatilidade 30

ABORDAGEM PROTEÔMICA E IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES Do geral para o particular Analisar proteomas de condições distintas e identificar as diferenças Do particular para o geral Analisar uma proteína e inferir suas funções no contexto do todo Separação de proteínas amostras Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC) fragmentação Espectrometria de Massas: Determinação de massas para identificação Impressão digital de peptídeos Sequenciamento de novo Bioinformática MANN et al. 2001 PROTEINA 31

Identificação da bactenecina no muco cervico-vaginal pela eletroforese-2 D em um modelo ovino de trabalho de parto MS/MS Indução de parto Dexametasona (+) Bactenecina 0 h 28 h Trabalho de parto YOUNG et al. (2007) 32

Análise proteômica de proteínas hipotalâmicas de linhagens de galinhas de alta e baixa produção de ovos corte 18 semanas 60 semanas CLAPMS/MS Ribonucleoproteína nuclear heterôgenea H 3 (HNRPH 3) poedeira (HNRPH 3) (+) KUO et al. (2007) 33

Proteína Osteopontina como biomarcador de fertilidade em bovinos AIDA et al. (1999) Purificação Sequenciamento identificação Alta fertilidade Osteopontina 55 k. Da; p. I = 6, 2 sêmen FIV Baixa fertilidade oócitos (+) KILLIAN et al. (1993) GONÇALVES et al. (2008) 34

Desafios na Abordagem Proteômica e Identificação Biomarcadores • Otimização dos bancos de dados • Detecção de proteínas em baixas concentrações; • Automatização das técnicas; 35

Perspectivas da abordagem proteômica e identificação de Biomarcadores • Diagnóstico e prognóstico de doenças e animais humanas e animais; • Seleção de animais de produção; • Descoberta de novos princípios da fisiologia celular; • “Metabolômica”; 36

Rodrigo V. De Oliveira oliveirarv@rocketmail. com 37