1 Bitki Biyoteknolojisi MOLEKLER ISLAH VE MARKR DESTEKL

1 Bitki Biyoteknolojisi MOLEKÜLER ISLAH VE MARKÖR DESTEKLİ SEÇİLİM (MAS)

2 • Dünya nüfusundaki artış • Yeni tarım alanlarının olmayışı • Birçok bitki türünde genetik varyasyonun daralması sonucu istenen özellikleri taşıyan çeşitlerin geliştirilmesinin zorlaşması • Bitki ıslahı çalışmalarını zorunlu hale getirmiştir.

3 Islah çalışmaları için gerekli varyasyon • tescilli çeşitlerden, • yerel çeşitlerden ve • yabani akrabalardan sağlanmaktadır. • Bu nedenle, bu materyallerin taranması ve belirlenen uygun genlerin geliştirilmiş tekniklerle kültür çeşitlerine aktarılması gerekmektedir. Ancak bitki ıslahında başarı öncelikle etkin, doğru ve hızlı bir seleksiyona bağlıdır

4 Klasik bitki ıslahı • Melezleme sonucu elde edilen ve açılım gösteren döller arasından üstün genotiplerin fenotipik seleksiyonuna dayanmaktadır. • Ancak genotipxçevre etkileşiminden dolayı bu uygulama oldukça zorlaşmaktadır. • Fenotipik seleksiyon pahalıdır ve bazı karakterler için (abiyotik stres koşullarına tolerans ile bağlantılı karakterler gibi) çoğu zaman uygulanabilir değildir. • Markör destekli seleksiyon, klasik bitki ıslahında karşılan bu sorunlara alternatif olarak geliştirilen bir yaklaşımdır.

5 Markörler • Kalıtım şekilleri izlenebilen karakterlere “markör” ya da “işaretçi” adı verilir. • Genomun özgün bir bölgesini tanımlamak amacıyla birçok markör sistemi kullanılmaktadır. • Genom analizleri ve genetik çalışmalar başta olmak üzere moleküler çalışmalarda kullanılırlar.

6 BİTKİ ISLAHINDA KULLANILAN Markör (BELİRTEÇ, işaretçi) TİPLERİ • Seleksiyonda kullanılacak markör tipleri ▫ Morfolojik markörler, ▫ Biyokimyasal markörler, ▫ DNA markörler • Bunlar içinde en güvenilir ve en çok kullanı DNA markörleridir.

7 Morfolojik markörler • Bu tip markörler özellikle özgün genler için güvenilir belirteçlerdir. • Ve bu özellikleri kodlayan genlerin kromozom üzerinde yerlerinin tanımlanmasında faydalı olmaktadırlar. • Ancak allel sayıları az olduğundan kullanımları kısıtlıdır (Liu, 1998).

8 Biyokimyasal markörleri (izoenzimler) • Amino asit bileşimi, moleküler ağırlıkları ve antikor-antijen ilişkilerindeki farklılıklar nedeniyle proteinler için farklı aleller bulunabilmektedir. • Protein markörler, morfolojik karakterlerle kıyaslandığında çok daha etkili sonuç vermelerine karşılık sıcaklık, stres koşulları, hastalık vb. faktörlerden etkilenirler • Etkili oldukları yer ve mevsimsel değişimlere göre farklılık gösterirler • Bu özellikler Kullanım alanlarını sınırlamaktadır

9 DNA markörleri • Moleküler markörlerdir. • Bir tür içerisindeki farklı bireylerde dizi polimorfizmi gösteren DNA bölgeleridir • Varyasyonun belirlenmesinde günümüzde en sık kullanılan yöntemdir (Liu, 1998). • Moleküler markörler; DNA’nın aktif bölgeleri olan genler üzerinde ya da gen kodlamayan genler arası bölgelerinde bulunabilirler. • DNA markörler DNA üzerinde belli bölgeleri hedef alarak, degişik bireylerin DNA’nın incelenen bölgesinde farklılık gösterip göstermediğini ortaya çıkaran markörlerdir

10 Gen • Proteinlerin yapı taşı olan amino asitlerin sentezlenebilmesi için gerekli bilgilerin bulunduğu DNA parçası GEN olarak ifade edilir. • Genin yapısı çok genel olarak kodlanan (ekzonlar) ve kodlanmayan (intronlar) bölgelerden meydana gelmektedir. • Bir gen tanımlanmadan önce DNA üzerinde saklanan gen bilgilerinin diğer bir nükleik asit olan RNA (Ribonükleik asit)’e aktarılması gerekmektedir. Bu olay transkripsiyon olarak tanımlanmaktadır. • Transkripsiyon sırasında intronlar kesilip atılmakta sadece ekzonik bölgeler RNA’da yer almaktadır.

Markörler hedef lokuslara çok yakın olmalıdır • İdeal olan markörlerin gene ya da QTL e <5 c. M dan daha yakın olması gerekmektedir. SEÇİLİMİN GÜVENİRLİĞİ Marker A 5 c. M Marker B Marker A 5 c. M • Sadece A markörü kullanılırsa: QTL 1 – r. A = ~95% A ve B kullanlırsa; 5 c. M 1 - 2 r. Ar. B = ~99. 5% QTL bölgesinin iki yanından markör kullanmak güvenirliği artırır ancak zaman ve maliyeti yükseltir.

Markörler polimorfik olmalıdır RM 84 1 2 3 4 5 6 7 8 RM 296 1 2 3 4 5 6 7 8 P 1 P 2 Not polymorphic Polymorphic!

13 DNA markörleri • Polimeraz Zincir Reaksiyonunun (PZR) keşfinden sonra genetik çalışmalarda PZR temelli markörler daha çok tercih edilmeye başlanmıştır. • Karry Mullis tarafından 1985 yılında ilk kez ortaya konulan bu teknoloji sayesinde genomun özgün bölgelerinin in vitro şartlarda çoğaltılabilmesi ve elektroforez teknikleri ile görüntülenmesi mümkün hale gelmiştir. • DNA teknolojisi ve moleküler biyolojideki hızlı gelişmeye paralel olarak daha ekonomik, kolay ve polimorfik olmalarından dolayı özellikle • PZR temelli DNA markör sistemleri (RFLP, RAPD, EST, STS, SSCP, AFLP, STR ve SNP) genetik çalışmalarda daha yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Weber and May, 1989; Liu, 1998).

14 DNA markörleri • Hibridizasyon (melezleme) temelli ▫ RFLP • PCR temelli ▫ ▫ RAPD SNP SSR ISSR

DNA izolasyonları Havanda dövme Porselen plaklar Yaprak örnekleme “Geno-Grinder” DNA ekstraksiyonu

PCR-temelli DNA markörleri PCR tamponu + Mg. Cl 2 + d. NTPS + PCR Taq + Primerler + Kalıp DNA TERMAL CYCLER (PCR) JEL ELEKTROFOREZİ Agaroz ya da akrilamid jel

Agaroz jel elektroforezi http: //arbl. cvmbs. colostate. edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna. html UV transilluminator UV ışığı

Akrilamid jel elektroforezi-1 UV transilluminator UV light

Akrilamid jel elektroforezi-2

20 Hibridizasyon temelli DNA markörleri: RFLP-Kesilmiş Parça uzunluğu polimorfizmi • Restriksiyon endonükleaz enzimlerinin kullanıldığı bu yöntemde, Restriksiyon endonükleazlar, restriksiyon bölgeleri olarak bilinen çift zincirli DNA'nın sadece spesifik baz dizilerini tanımakta ve diziyi bu bölgelerden kesmektedir.

21 RFLP-Kesilmiş Parça uzunluğu polimorfizmi • DNA’nın belirli nükleotid dizilerinden enzimlerle kesilerek çeşitli büyüklüklerde DNA parçaları elde edilmesi prensibine dayanmaktadır. • Güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği yüksektir. • Ancak, çok miktarda temiz DNA gerekliliği ve maliyetinin yüksek olması tekniğin kullanımını sınırlandıran başlıca faktörlerdir

22 RFLP aşamaları • 1. DNA İzolasyonu • 2. DNA’nın restriksiyon enzimleri ile kesilmesi • 3. Kesilen DNA’ların radyoaktif problarla işaretlenmesi • 4. Görüntülenmesi

23 RAPD - Rasgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA • RAPD, gelişigüzel ve kısa bir primer ile PCR yardımıyla hedef DNA’nın çoğaltılmasıdır. • Bu teknikte genellikle 10 nükleotid uzunluğundaki primer (başlatıcı) tek sarmallı DNA’lar kullanılarak genom üzerinde rastgele bölgelerin DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. • Reaksiyon şartlarının spesifik olmaması rastgele çoğaltıma izin verir. • Diğer PCR uygulamalarının aksine iki değil tek bir primer kullanılır. • Üretimi yapılan DNA parçaları (amplikon) agaroz jel üzerinde elektroforeze tabi tutulduğunda bazı parçaların bazı genotiplerde üretilip bazılarında üretilmediği gözlenir

24 RAPD

25 AFLP- Çoğaltılmış Parça Uzunluğu Polimorfizmi • Teknik temel olarak aşağıdaki şekilde uygulanmaktadır. ▫ (AFLP tekniği PCR aşaması öncesi) • DNA’nın spesifik restriksiyon enzimleri ile (Eco. R 1/Mse I) kesimi ve bu enzim sistemlerine uygun adaptörlerin (primerlerin) kesim bölgelerine DNA ligaz enzimi ile birleştirilmesi, • Ligaz edilen bu bölgelere (adaptörlere) uygun primerler ile restriksiyon fragmentlerinin ön çoğaltımı (pre-amplifikasyonu) ▫ (AFLP tekniği PCR aşaması) • Bu fragmentlerin özel oluşturulan ve değişik şekillerde (radyoaktif veya biotin vb) işaretlenmiş primerlerle DNA bölgelerinin çogaltımının (amplifikasyonunun) sağlanması ve • Sonuçların poliakrikamid jel elektroforezinde görüntülenmesi, aşamalarından oluşmaktadır.

26 24. 03. 2020

27 AFLP

28 SSR – Basit Dizi Tekrarları (Mikrosatelitler) • Mikrosatelitler, iki, üç, dört ya da beş nükleotidden oluşan kısa DNA dizilerinin değişken sayıda arda tekrarlanmasından oluşurlar. • Bu teknik günümüzde oldukça fazla kullanılan bir tekniktir.

29 SSR • Nedeni ise; ▫ Polimorfizm orani oldukça fazla olması yanında tekrarlanabilirligi (farkli kisilerin farkli labaratuvarlarda yapmis oldugu deneylerden aynı sonuç almaları) ▫ Genomda bol olması, ▫ Mendel kalıtımına uygunluğu, ▫ Kodominantlık ▫ Farklı laboratuvarlarda tekrar üretilebilir olması

30 SSR • Mikrosatelitler: Bitki DNA’sında bulunan birbirinin ardısıra tekrarlanan 2 -4 baz • uzunluğundaki (GA)n, (CA)n, (ATA)n, (CTT)n ve (GATA)n kısa DNA dizileridir • Tekrarlanma sayıları bireyden bireye farklılık göstermektedir • Bu özelliği nedeniyle tanımlama çalışmalarında kullanılmaktadırlar

31 SSR

32 ISSR- BASi. T SEKANS TEKRARLAR ARASI POLIMORFIZIM • Bu teknikte genellikle tek bir primer kullanılır. • Primer uzunluğu 16 -20 nt olup duruma göre primerin uçlarından biri 2 -4 baz uzatılır. Primerin bu uzantılar içerisindeki kısmında tekrarlı bazlar bulunur. • ISSR primerine örnek: • 5. -ACACACACCTC-3. • Burada CCTC ardışık tekrarın 3. - ucuna eklenen nükleotidleri gösterir • Çok sayıda lokus aynı anda izlenebilmektedir.

33 ISSR jel görüntüsü

34 DNA markörlerinin avantajları: • Moleküler belirteç sistemlerini kullanmanın fenotipik karakterler yoluyla ıslah çalışmalarına temel üstünlüğü bu sistemlerin biotik ve abiotik stres koşullarından bağımsız olmalarıdır. • Moleküler belirteçler yoluyla ıslah tekniği tahıllar ve diğer ürünlerde kolaylıkla adapte olmuş teknikler arasındadır. • Moleküler belirteç sistemleri ıslah çalışmalarına hız sağlarlar. • Doğrulama ya da tanımlama, genetik kaynakların tespiti ve tanımlanması, genetik çeşitliliğin belirlenmesi gibi amaçlarla kullanılabilmektedir.

35 Moleküler Markörlerin rolü • Bitkiler arasındaki genetik farklılıkları (polimorfizm) ortaya koymak (genetik tanımlama) • Akrabalık ilişkilerini ortaya çıkarmak • Melezleme ıslahında hibrit bitki tanısı • Genetik Haritalama • Marköre Dayalı Seleksiyon (MAS)

36 GENETİK HARİTA HAZIRLIĞI • Genetik harita elde edebilmek için hangi genetik element veya genlerin melez bitkilerde bir arada ortaya çıktığının belirlenmesi gereklidir. • Çünkü bunlar genetik olarak birbirine bağlıdır ve kromozom üzerinde birlikte yer alırlar. • İkinci adım, kromozom üzerinde birlikte yer alan genetik elementlerin kromozomda hangi sırayla sıralandıklarının bilinmesidir. • Burada Kalıtımın ikinci bir bilgisi devreye girer • “Rekombinasyon”.

37 Genetik haritalama • Haritalama birimi olarak centimorgan (c. M) kullanılır. • %1 rekombinasyon 1 c. M’ birimine eşittir. • Rekombinasyon sıklığı ve genetik mesafe her zaman birebir olmaz. • İki gen arasındaki mesafe 10 c. M’dan düşük ise bir bağlantıdan söz edilebilir. • r= 0, 10 = 10 c. M, r= 0, 30 = 45, 8 c. M, r= 0, 35 = 60, 2 c. M (Staub ve ark. , 1996)

38 MAS-Markör destekli Seçilim Hedef lokuslara çok sıkı bağlanmış DNA markörlerinin fenotipik taramaya yardımcı olması için temsilci olarak kullanılmasıdır DNA markörlerinin fenotipi doğru bir şekilde tahmin edeceği varsayımına dayanır.

Geleneksel bitki ıslahı P 1 x P 2 Verici Alıcı F 1 Binlerce bitkiden oluşan büyük populasyonlar F 2 FENOTİPİK SEÇİLİM Tuzluluk Sera denemeleri Bakteri yanıklığı hastalığı Fosfor noksanlığı Arazi denemeleri

MARKÖR DESTEKLİ SEÇİLİM P 1 x Duyarlı P 2 Dirençli F 1 F 2 Binlerce bitkiden meydana gelen büyük populasyonlar MARKÖR DESTEKLİ SEÇİLİM FENOTİPİK SEÇİLİM DNA MARKÖRLERİNE DAYALI

MAS IN AVANTAJLARI • Fenotipik taramaya göre daha basit bir metoddur ▫ Özellikle çok zahmetli tarama gerektiren karakterler için ▫ Zaman ve kaynak tasarrufu • Tohum basamağında seçilim ▫ Tahıl kalitesi gibi karakterler için önemlidir ▫ Pirinçte şaşırtmadan önce seçebilir • Artan güvenirlilik ▫ Çevre etkisi yok ▫ Homozigot ve heterozigotlar arasında ayırım yapabilir ve tek bitkileri seçebilir

MAS ın potansiyel yararları • Spesifik fenotiplerin daha doğru ve etkin seçilimi ▫ Hızlanmış varyete gelişimi • Kaynakların daha etkin kullanımı ▫ Özellikle denemeleri sera arazi geriçaprazlama

Markör genotipleme özeti (1) Yaprak doku örnekleme (2) DNA izolasyonu (3) PCR (4) Jel elektroforezi (5) Markör analizi

44 MAS VE BİTKİ ISLAHINDAKİ UYGULAMA ALANLARI • 1. MAS Deneysel Uygulama Basamakları ▫ MAS uygulamalarının gelişimi mısır ile başlamış ve bunu buğday takip etmiştir. Arpa uygulamaları da buğdayda yapılan çalışmalara çok benzemektedir. Tahıllar arasında model bitki olması nedeniyle çeltik üzerinde de birçok araştırma yapılmıştır.

45 1. MAS Deneysel Uygulama Basamakları • Genom dizi haritası geliştirilir. Quantitative Trait Loci (QTL), spesifik bir özelliği kontrol eden çoklu genlerin dizi haritalarında bulunduğu bölgedir. Popülasyonların ayrımında kullanılan etkili bir yöntemdir. Küçükte olsa QTL üzerindeki değişiklikler fenotiplerde farklılıklar ortaya çıkarır.

46 1. MAS Deneysel Uygulama Basamakları • Islah sürecinde QTL ile bağlantılı PCR temelli moleküler belirteçler seçilir. Bitki genomlarının fiziksel haritalaması için Rekstriksiyon parça uzunluk polimorfizmi (RFLP, PCR temelli olmayan), Rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA (RAPD) ve Çoğaltılmış parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) ilk olarak genellikle popülasyon genetiği ve ıslah çalışmalarında kullanılmıştır. Fenotipik bir özelliğin izlenmesi için de kullanılırlar.

47 1. MAS Deneysel Uygulama Basamakları • Genomik fiziksel dönüm noktalarındaki rastgele primerlenmiş PCR ürünlerini dönüştürmek için ‘Sequence-Specific Markers (SCAR)’ tekniği dizayn edilmiştir. Mikrosatellit belirteç teknikleri, birey içi ve bireyler arası mikrosatellitlerdeki ya da tek dizi tekrar bölgelerindeki varyasyonlarda parmak izi analizleri için kullanılmıştır.

48 1. MAS Deneysel Uygulama Basamakları • Kloroplast ve mitokondri mikrosatellit teknikleri de ıslah ve evrim çalışmalarında kullanılmıştır. Bitki genomunda Expressed Sequence Tags (EST)’nin bulunmasıyla Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPs) gibi sekansa spesifik belirteçler geliştirilmiştir. Genellikle Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) formundaki popülasyonda genlerin allelik varyasyonlarında kullanılmıştır. Yeni genomik elemanlardan retrotranspozon temelli belirteçler yardımıyla da yakın bireyler arasındaki genom boyunca devamsızlıklar analiz edilmiştir.

49 2. MAS Çalışmalarının Avantajları • Fenotipik taramaya göre daha kolay bir metottur. Özellikle tanımlanması zahmetli özelliklerde zaman ve kaynak israfını engeller. • Çimlenme aşamasında seleksiyon sağlayarak tane kalitesi gibi özelliklerin tanısında kolaylık sağlar. Örneğin çeltikte ekimden önce seleksiyon yapılarak tane kalitesi belirlenmiş olur.

50 2. MAS Çalışmalarının Avantajları • Çevresel faktörlerden etkilenmediği için güvenilirliği yüksektir. Homozigot ve heterozigot ırkları ayırarak tek bitkinin seçimini sağlar. • Ülkemizde var olan genetik kaynakların tam bir kimlik tespitlerinin yapılmasını bu yolla genetik rezervin korunmasını sağlar.

51 2. MAS Çalışmalarının Avantajları • Herhangi bir çeşit karışıklığı durumunda ayrımı ve bu yolla çeşitlerin satış işlemi gibi ticari haklarının korunmasına yardımcı olur. • Spesifik özellikteki genotiplerin daha titiz, doğru şekilde ayrımını sağlar.

52 3. MAS Çalışmalarında Yaklaşımlar • Geri Çaprazlama: ▫ Hedef bölgenin etkili bir şekilde seçimini sağlar, bağlantı taramalarını minimize eder, tekrar eden ebeveynlerin tespitini kolaylaştırır. • Piramitleme: ▫ Patojenlerin spesifik dozları için çoklu hastalık direnç genlerinin tespitinde hız sağlar (geleneksel yöntemlerle olanaklı değildir).

53 3. MAS Çalışmalarında Yaklaşımlar • Erken Safhada Döl Seçimi ▫ MAS F 2 ve F 3 basamaklarında gerçekleştirildiğinden, ıslah programlarının sonraki aşamalarında avantaj sağlar çünkü kaynak tam olarak tespit edilmiş olur. • Birleştirilmiş yaklaşımlar: ▫ Bazı durumlarda fenotipik çalışmalar ile MAS’ı birleştirmek faydalı olabilir

54 • Markörler istenilen genin DNA dizisine yakın lokalize olmaktadırlar. • Markörler ve genler yanı kromozom üzerinde birbirine çok yakın olduklarından her bir nesilde birlikte kalıtılırlar. Buna genetik bağlantı adı verilir. Bu istediğimiz genin bitkide olup olmadığını bulmamıza yardım eder. • Eğer ilgili genin markörü bulunabilise bu genin kendisinin bulunduğunu gösterir.

55 • Eğer markörlerin kromozomda nerede oldukları ve spesifik bir gene ne kadar yakın olduğu öğrenilirse spesifik kromozomlarda genler ve markörlerin haritası çıkarılabilir. • Bu genetik bağlantı haritaları markör ve genlerin lokasyonlarını ve bilinen genlere mesafelerini gösterir. • Bu şekilde bitki ıslahının sadece bir neslinde detaylı haritalar çıkarılabilir.

56 • Markör destekli ıslah özel bir karakter için gen ve markörlerin bilindiği bitkilerin ıslahında rutin olarak kulllanılır. Ör, pirinçte bakteriyel yanıklık hastalığına direnç, artmış beta karoten içeriği gibi öneli genlerin aktarılması. • Moleküler markörler bir hat ya da varyetenin genetik profilini belirlemede de kullanılır. Rastgele primerler kullanılarak moleküler metodlarla bitki genomu taranır. Elde edilen veriler bilgisayar programına aktarılır ve burada ilgili hattın diğerleri ile olan ilişkisi/akrabalığı analiz edilir. • Hatların genetik çeşitliliğine dair bilgi hibrit tohum teknolojisi için yayarlı son derece uzak ebeveynlerin seçiminde kullanılmaktadır. • Ayrıca bu bilgi hatların soyları, olası karakterler ve üreme hücreleri veritabanları için bitkinin özgün teşhisleri hakkında detaylar barındırır.

57 • Ancak, MAS ile moleküler ıslah genetik mühendisliği ya da modifikasyonla karşılaştırıldığında bir miktar kısıtlı özelliktedir. Çünkü; ▫ 1) Zaten bitkide sadece mevcut olan karakterlerle çalışır. ▫ 2) uzun jenerasyon süresi olan bitkilerin ıslahında etki olarak kullanılamaz. (ör, citrus-turunçgil, limon) ▫ Steril oldukları için ya da yavru döller evebeynlere benzemedikleri için klonla çoğaltılan bitkiler için etkin olarak kullanılamaz (yer elması, muz, tatlı patates, manyot)