1 Biotecnologie tecniche e applicazioni 2 Zanichelli editore

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Biotecnologie: tecniche e applicazioni 2 © Zanichelli editore 2016

Il clonaggio e il DNA ricombinante Il clonaggio è una tecnologia usata per ottenere molte copie di un frammento di DNA, introducendolo in organismi ospiti con l’uso di vettori. Il DNA ricombinante indica una molecola di DNA in cui sia presente l’informazione genetica proveniente da due o più organismi differenti. 3 © Zanichelli editore 2016

Il c. DNA Il primo passo del clonaggio è l’isolamento di una sequenza di DNA. È possibile clonare un filamento di DNA o la copia a DNA di un m. RNA; quest’ultimo approccio è il più comune nelle biotecnologie. Le copie a DNA di un m. RNA sono chiamate c. DNA (DNA complementare) e possono essere raccolte in librerie di c. DNA. 4 © Zanichelli editore 2016

La trascrittasi inversa /1 L’enzima trascrittasi inversa genera c. DNA da uno stampo di m. RNA. AUAAC 5’ 3’ 5’ TATTG L’enzima inizialmente copia il singolo filamento di m. RNA, producendo un ibrido DNA/RNA a doppio filamento. ……. . AUAAC ibrido DNA/RNA 3’ ……. . TATTG 5 © Zanichelli editore 2016

La trascrittasi inversa /2 3’ ……. . TATTG 5’ ……. . ATAAC 3’ ……. . TATTG La trascrittasi inversa può degradare il filamento di RNA, lasciando un singolo filamento di DNA. In seguito sintetizza il filamento di DNA complementare, generando un c. DNA a doppio filamento. 6 © Zanichelli editore 2016

I vettori di clonaggio I vettori plasmidici sono molecole di DNA circolare che possono essere usati per introdurre c. DNA nelle cellule ospiti. I plasmidi sono elementi genetici che si trovano nei batteri e che possono essere modificati in laboratorio. gene reporter sito di restrizione origine di replicazione © Zanichelli editore 2016 I vettori plasmidici hanno un origine di replicazione (ori), un gene reporter (per esempio, la resistenza a un antibiotico) e siti di restrizione, che possono essere riconosciuti da enzimi di restrizione. 7

Gli enzimi di restrizione riconoscono specifiche sequenze di DNA (sequenza di riconoscimento o sito di restrizione), a livello delle quali tagliano la doppia elica. sito di taglio ……. . GGTGAATTCAGC…ATGCAGCTGTAGC…… ……. CCACTTAAGTCG…ATCGTCGACATCG…… sequenza di riconoscimento © Zanichelli editore 2016 8

Le DNA ligasi Per inserire un c. DNA in un vettore, è necessaria l’azione dell’enzima DNA ligasi. Le DNA ligasi sono enzimi che catalizzano la formazione di un legame fosfodiesterico tra due nucleotidi, legando insieme due filamenti di DNA. 5’ 3’ ……. . ATAAC ……. . TATTG 3’ 5’ 5’ 3’ ……. . CGGAT ……. . GCCTA 3’ 5’ DNA ligasi 5’ 3’ ……. . ATAAC ……. . TATTG 3’ 5’ 9 © Zanichelli editore 2016

Il clonaggio e la selezione /1 Le sequenze di c. DNA e il vettore di clonaggio sono trattati con lo stesso enzima di restrizione, in modo che le estremità tagliate delle molecole siano complementari. enzima di restrizione i frammenti di c. DNA si mescolano ai frammenti di DNA plasmidico 10 © Zanichelli editore 2016

Il clonaggio e la selezione /2 DNA ligasi La DNA ligasi unisce il c. DNA all’interno dei vettori plasmidici. Il DNA ricombinante (vettori che contengono c. DNA) è inserito nelle cellule batteriche, in un processo chiamato trasformazione. Solo alcune cellule ricevono il plasmide. 11 © Zanichelli editore 2016

Il clonaggio e la selezione /3 Le cellule che contengono il vettore hanno acquisito la resistenza a un antibiotico; in questo modo è possibile selezionarle mettendo le cellule in un mezzo di coltura che contiene l’antibiotico. 12 © Zanichelli editore 2016

La PCR: amplificare una sequenza genica La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnologia usata per ottenere molte copie di una sequenza di DNA. Consiste in una serie di cicli di denaturazione, appaiamento dei primer e allungamento. Alla fine la sequenza originaria è amplificata per ogni ciclo n di un fattore 2 n (32 cicli = = 232 copie = > 109 copie). 13 © Zanichelli editore 2016

Il sequenziamento del DNA /1 Per “leggere” il tipo e l’ordine dei nucleotidi in una molecola di DNA è necessario avere: • un filamento di DNA stampo – la sequenza che vogliamo conoscere; • un primer complementare a una regione del DNA stampo; • l’enzima DNA polimerasi; • un mix di 4 d. NTP (desossiribonucleosidi trifosfati); • dd. NTP (didesossiribonucleosidi trifosfati) marcati con fluorescenza. 14 © Zanichelli editore 2016

Il sequenziamento del DNA /2 La DNA polimerasi è messa in incubazione insieme al DNA stampo, 4 d. NTP e uno specifico dd. NTP, che ferma l’allungamento della catena. Con 4 reazioni separate, una per ciascun dd. NTP, è possibile identificare ogni base nel DNA stampo. La PCR permette l’uso di una piccola quantità di DNA per ottenere un sequenziamento. 15 © Zanichelli editore 2016

Il Progetto Genoma Umano Nel 2003 il Progetto Genoma Umano ha annunciato il sequenziamento completo del genoma umano. È stato un progetto di ricerca internazionale, finanziato con fondi pubblici e iniziato nel 1990. I risultati del progetto possono essere utili per: • identificare mutazioni associate a diverse malattie; • progettare farmaci e trattamenti più efficaci; • studiare l’evoluzione umana; • migliorare le scienze forensi. 16 © Zanichelli editore 2016

Le biotecnologie forensi Le biotecnologie hanno cambiato la ricerca scientifica nelle investigazioni criminali: • con la PCR è possibile amplificare anche piccole quantità di DNA da campioni biologici; • è possibile fornire un profilo genetico unico a un campione di DNA. 17 © Zanichelli editore 2016

L’impronta genetica Ciascun individuo possiede una propria impronta genetica (DNA fingerprint) che lo caratterizza in modo unico. La tecnica per ottenere l’impronta genetica utilizza brevi sequenze ripetitive che sono molto variabili (SRT, short tandem repeats), costituite dalla ripetizione di 3 -5 nucleotidi. Dopo l’amplificazione con PCR, i prodotti sono mostrati su gel di agarosio. 18 © Zanichelli editore 2016

Organismi geneticamente modificati Le biotecnologie possono essere utilizzate per modificare il genoma di alcuni organismi (OGM, organismi geneticamente modificati), per generare nuove varietà o per cancellare, introdurre o modificare una caratteristica dell’organismo. È possibile modificare geneticamente batteri, animali o piante. 19 © Zanichelli editore 2016

Le biotecnologie e l’agricoltura In agricoltura sono state utilizzate alcune specie geneticamente modificate per ottenere: • migliori processi di maturazione; • resistenza ai diserbanti (o ad altri trattamenti chimici); • resistenza agli stress (freddo, salinità, siccità); • resistenza ai parassiti (virus, batteri, insetti, funghi); • miglior valore nutrizionale; • produzione di proteine ricombinanti esogene (enzimi, anticorpi, antigeni per vaccini). 20 © Zanichelli editore 2016

Esempi di piante geneticamente modificate Resistenza ai diserbanti: mais, cotone, soia, in cui è stato inserito un gene che permette alle piante di sopravvivere all’uso di diserbanti. Resistenza allo stress: mais con il gene MAP chinasi della pianta Arabidopsis, che conferisce resistenza al freddo, al caldo e alla salinità. Resistenza ai parassiti: tabacco e zucchine con un gene del virus del mosaico del tabacco; cotone e mais con la tossina Bt del Bacillus thuringiensis. 21 © Zanichelli editore 2016

Il Golden Rice è una varietà di riso geneticamente modificata che esprime 4 geni batterici per la sintesi di beta-carotene, un precursore della vitamina A. Questa varietà di riso può essere utile in aree povere del mondo, dove la carenza di vitamina A causa 800 000 morti ogni anno tra i bambini e le donne incinte. 22 © Zanichelli editore 2016

Possibili problemi associati con le coltivazioni OGM • Possibili rischi di impollinazione incrociata con varietà naturali. • Possibili reazioni allergiche a proteine esogene nei consumatori. • Rischio di monopolio di pochi grandi produttori di semi GM. • Legislazione eterogenea in diversi Paesi riguardo ai brevetti sulle tecniche, sui semi e sulle varietà GM. Al momento, dagli studi scientifici non sono emersi rischi per la salute, ma è necessario tenere alta l’attenzione. 23 © Zanichelli editore 2016

Le cellule staminali sono cellule indifferenziate, che si possono differenziare in diversi tipi di cellule specializzate. Nelle biotecnologie, è possibile utilizzare: • cellule staminali embrionali; • cellule staminali adulte; • cellule staminali pluripotenti indotte (i. PSC). 24 © Zanichelli editore 2016

Le cellule staminali embrionali (ESC) derivano dalla massa cellulare interna degli embrioni nelle prime fasi di sviluppo. Le ESC sono pluripotenti: possono differenziarsi in molti tipi di cellula presente nell’organismo adulto. Il differenziamento può essere indotto con specifici fattori di crescita. 25 © Zanichelli editore 2016

Le cellule staminali adulte sono precursori presenti in diversi tessuti nell’organismo adulto, utilizzati per rimpiazzare le cellule vecchie. Sono multipotenti: si possono differenziare in alcuni tipi di cellule. Le cellule staminali emopoietiche, del midollo osseo, possono differenziarsi in cellule mieloidi o linfoidi. 26 © Zanichelli editore 2016

Le cellule staminali pluripotenti indotte possono essere generate a partire da cellule adulte. La tecnica consiste nell’invertire il programma di differenziamento, introducendo nelle cellule adulte geni che codificano per fattori di trascrizione. Una volta riprogrammate, possono differenziarsi in diversi tipi di cellule. 27 © Zanichelli editore 2016

Le applicazioni delle cellule staminali Le cellule staminali possono essere utilizzate: • nei trapianti per rimpiazzare cellule malate (per esempio, le cellule staminali emopoietiche sono usate per rigenerare il midollo osseo nei pazienti affetti da leucemia); • per generare tessuti sani che possano rimpiazzare tessuti malati nei pazienti (per esempio, nel caso del diabete); • per riparare tessuti danneggiati (per esempio, nel caso di ustioni). 28 © Zanichelli editore 2016