07062021 Deteccin y genotipificacin de norovirus GIGII mediante

07/06/2021 “Detección y genotipificación de norovirus GI/GII mediante Real Time (Taq. Man®) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), en muestras de heces de niños menores de 5 años de edad que presentaron episodios esporádicos de diarrea aguda en el cantón Quinindé, provincia de Esmeraldas – Ecuador”. Elizabeth Guambo C.

Planteamiento del problema Anualmente: 700 millones de casos 2 - 5 millones muertes (Asia, África y América Latina) 70 -80% 15% 5% (Blacklow & Greenberg, 1991)(Thomas & Lynch, 2007) (Kosek, Bern & Guerrant, 2003) Etiología DESCONOCIDA Segunda causa de muerte en niños < 5 años a nivel mundial (OMS, 2009) EDA calicivirus humanos NOROVIRUS Problema de salud pública 2 07/06/2021 (CDC, 2010)

Justificación En América Latina y el Caribe: 1, 32 millones de casos anuales 77 600 niños menores de cinco años fallecen (200 muertes diarias) (OPS, 2010) E D A 3 Ecuador: Décimo lugar de entre las doce principales causas de mortalidad infantil (CIE-10 , 2008) 07/06/2021

Justificación • Principal causa de gastroenteritis viral esporádica aguda en personas de todas las edades • Segunda en niños menores(CDC, de 2010) 5 años Vía de transmisión • Oral - fecal • Ingesta de alimentos y/o agua (SEE, 2007) Prevalencia e incidencia alta Incapacidad de aislar y cultivar in vitro Fácil propagación No existe un prototipo animal NOROVIRUS Capacidad infectiva elevada Extremadamente resistente • 10 a 100 partículas • Período de incubación corto • Condiciones ambientales • Desinfectantes usuales (Ribes y Buesa, 2010) 4 modelo experimental real de la patogenia en humanos (Evans, et al. , 2002) 07/06/2021

Objetivos Objetivo general Ø Detectar y genotipificar norovirus GI/GII mediante Real Time (Taq. Man®) Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), en muestras de heces de niños menores de cinco años de edad que presentaron episodios esporádicos de diarrea aguda en el cantón Quinindé, provincia de Esmeraldas – Ecuador. 5 07/06/2021

Objetivos específicos Ø Estimar la prevalencia del síndrome diarreico agudo causado por norovirus GI/GII, en la población de estudio. Ø Determinar la distribución estacional de la infección por norovirus GI/GII. Ø Establecer los factores de riesgo (sociales, económicos y sanitarios) asociados a la expresión del potencial patogénico de norovirus GI/GII. 6 07/06/2021

personas • • Taxonomía Familia caliciviridae calicivirus humanos [+]ss. RNA (clase IV Baltimore) 5 géneros de virus • (ICTV, 2010) Género norovirus 5 agrupaciones filogenéticas o genogrupos (GI hasta GV). (ICTV, 2010) 70 al 80% de los brotes de gastroenteritis no bacteriana en todo el mundo (Zheng, et al. , 2000) 7 animales 07/06/2021

Hospederos naturales Principal reservorio confirmado Tracto gastrointestinal del ser humano animales (Van der Poel, et al. , 2000) 8 07/06/2021

Mecanismos de transmisión Indirecta Directa Fecal -Oral (transmisión primaria) Alimentos Agua Aérea (vómitos) Fómites o superf icies contaminadas Mantener una sucesión de los brotes (CDC, 2001) 9 07/06/2021

Sintomatología clínica Otros (CDC, 2002) Fotofobia vómitos (69%) náuseas (79%) Rigidez de nuca dolor abdominal (30%) diarrea no sanguinolenta (66%) Confusión encefalopatías fiebre (37%) cambios de conducta o en los niveles de conciencia Periodo de incubación: 10 – 51 horas (24 h) (Kaplan, et al. , 1982). 10 07/06/2021 (Gutiérrez y Ludert, s/a).

Patogénesis Lesiones anatomopatológicas reversibles yeyuno Incremento del espacio intercelular Acortamiento de las microvellosidades Cantidad variable de liquido intestinal Alteración de la motilidad gástrica en el Retraso del vaciamiento gástrico No enterotoxinas Schreiber, Blacklow & Trier, 1973) 11 07/06/2021

Factores de riesgo >65 Edad (Tregan, s/a) Género Grupo de riesgo (Patel, et al. , 2008) (FUT 2) <5 • Genéticamente determinados HBGA Raza Susceptibilidad "secretores" "no-secretores" O: > • Fenotipo sanguíneo B: < < riesgo (Lindesmith, et al. , 2003) (Tregan, s/a) 12 07/06/2021

Diagnóstico de laboratorio Microscopía Electrónica (ME) Enzimoinmunoensayo (ELISA) Técnicas inmunocromatográficas “gold standard” Reacción en cadena de la polimerasa en transcripción reversa (RT-PCR) REAL TIME 13 07/06/2021 (Parashar, et al. , 2001)

Tratamiento No cuenta con tratamiento específico Restaurar la función fisiológica normal (rehidratación). SRO o rehidratación parenteral Alimentación precoz Antibioticos, antiperistálticos o antisecretores deben evitarse 14 07/06/2021

Sistema de hipótesis Ø El norovirus GII es el genotipo más frecuente relacionado con episodios esporádicos de diarrea aguda en niños menores de 5 años del cantón Quinindé, provincia de Esmeraldas – Ecuador. 15 07/06/2021

Zona de estudio Trabajo de campo Trabajo de laboratorio Análisis clínico 244 niños Junio del 2009 y octubre del 2010 (17 meses) Análisis molecular Perímetro urbano del cantón Quinindé (desde los recintos hasta la Marujita en la vía Santo Domingo de los Tsachilas hasta Cupa en la vía Esmeraldas) “Formulario N” 16 07/06/2021

Procedimientos Alícuota de 1 m. L de la muestra Examen microscópico directo o en fresco Técnica de Kato–Katz Recepción, recolección y toma de muestras (heces) Análisis clínico 48 -72 horas 9 días máximo > 5 g textura pastosa o semisolida > 10 m. L liquidas 17 Técnica de concentración: formol-acetato etílico Pre-extracción: (10 – 20% peso/volumen) Análisis Molecular PBS Extracción y purificación de RNA viral : ® QIAamp Viral RNA (QIAGEN). Real Time (Taq. Man®) RT-PCR: Ag. Path-ID™ One-Step RT-PCR Kit (Applied Biosystems) 07/06/2021

Real Time (Taq. Man®) RT-PCR Primers/probes GENOTIPO I Primer/probe mix [10µM] CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA Cog 1 R CTT AGA CGC CAT CAT TYA C Ring 1 C FAM – AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA – BHQ* 97 pb Cog 2 F CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG Cog 2 R TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA Ring 2 QUA – TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT – BHQ** R = A o G; B = C, G o T; Y = C o T; N = Cualquier nucleótido (Trujillo, et al. , 2006) 18 Integrated DNA Technologies 84 pb Cog 1 F GENOTIPO II a secuencia de cruce entre ORF 1 y ORF 2 07/06/2021

Real Time (Taq. Man®) RT-PCR Master Mix Componente Volumen (µL)/rxn Condiciones de amplificación 12, 50 Ciclos Tiempo Primer/probea Mix 0, 5 1 10 min 45 25 X RT-PCR Mix* 1 1 10 min 95 40 15 seg 95 Detection enhancer* 1, 67 1 min 60 Nuclease-free wáter* 6, 33 Volumen Total 22 μL El volumen de reacción final se ajustó a 25μL, añadiendo 3μL de la muestra 19 Temperatura 2 X RT-PCR buffer* 07/06/2021 (°C)

Diseño estadístico Prevalencia (Varela y Rial, 2008) Regresión logística Factores de Riesgo Chi-cuadrado (χ2) • Evaluar posibles diferencias estadísticas entre las variables (Prieto & Herranz, 2010) Test para la igualdad de proporciones poblacionales 20 • Determinar relaciones entre la presencia de norovirus y los diferentes indicadores (Díaz, 2006) • Cuantificación de asociaciones: (Taucher, 1997) • >1 relación positiva Odds ratio • =1 no relación Backward • <1 relación negativa 07/06/2021 (OR)

Descripción general de la muestra Edad • < 1 año: 65, 5% • > 1 año: 34, 4% Estación • Seca: 76, 6% • Lluviosa: 23, 4%

Resultados y discusión 22. 95% Protozoarios intestinales 18. 03% 8. 19% in is m es m Tr ic lo m hi C ho m as on as tix ax ol im En d En 19. 67% 39. 34% 4. 91% ni li na na bl ia ia ia rd G ta m oe ba hi st ol y la m tic a Ø Prevalencia: 14, 75% (36/244) 6. 55% ho Análisis coproparasitológico Helmintos intestinales 11. 47% 60. 65% 6. 55% Protozoarios 1. 63% Helmintos Trichuris trichiu Ascaris ra lumbricoides 22 07/06/2021 Hymenolepis Strongyloides s nana tercoralis

Resultados y discusión 16, 76% Análisis molecular: norovirus 32% Ø Prevalencia: 29, 5% (72/244) 9. 72% 16. 66% 29, 5% 14. 5% 17, 4% 24% 73. 61% GI GI & GII No se encontró ningún patrón estacional 23 07/06/2021

Resultados y discusión Factores de riesgo 95% C. I. for Exp(B) Variables Sig. Edad < 1 año Material de construcción de la Cemento vivienda bloque/ladrillo Electrodoméstico Fuente de agua Exp(B) Lower Upper 0. 511 1. 236 . 430 1. 523 0. 044 2. 082 1. 020 4. 250 3 a 4 0. 092 1. 727 . 915 3. 257 Entubada 0. 087 1. 700 . 926 3. 120 Perro dentro de la vivienda 0. 007 . 265 . 101 . 695 0. 075 2. 936 . 897 9. 615 Presencia de animales domésticos Caballo alrededor de la vivienda 24 07/06/2021

Conclusiones Ø La prevalencia de parásitos intestinales en la población de estudio fue del 14, 75%, de los cuales el 60, 65% correspondió a protozoarios intestinales y el 39, 34% a helmintos intestinales. Ø El uso de la Real Time (Taq. Man®) RT-PCR permitió estimar una prevalencia del 29, 5% para el síndrome diarreico agudo causado por norovirus GI/GII, en niños menores de cinco años de edad del noroccidente del país. Ø El genotipo de norovirus predominante fue el GII, siendo responsable del 73, 61% del total de los casos positivos, seguidas por el Genotipo I con el 16, 66% y el 9, 72% restante se atribuyó a una infección mixta entre el Genotipo I y II. 25 07/06/2021

Conclusiones Ø No se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa en el patrón estacional de la infección por norovirus, distribuyéndose de forma uniforme a lo largo de todo el año. Ø Con respecto a la edad de la población se determinó que en la lactancia, el riesgo de padecer gastroenteritis aguda causada por norovirus se vio aumentado 1, 23 veces. Ø Entre los potenciales factores de riesgo relacionados con las condiciones socio-económicas del hogar se determinó que el acceso a una mejor calidad de vida incrementó el riesgo de padecer enfermedades diarreicas causadas por norovirus. 26 07/06/2021

Conclusiones Ø La presencia de canes en el interior de la vivienda cumple un papel protector, mientras que la exposición o contacto de los menores con equinos eleva 3 veces la posibilidad de afectarse con norovirus.

Recomendaciones Ø Debido a la alta prevalencia de norovirus encontrada en niños menores de cinco años de edad del noroccidente del país, se invita al ministerio de salud pública del Ecuador a profundizar el tema del impacto de los norovirus en la población infantil y los factores de riesgo involucrados con la afección que estos provocan, ampliando el presente estudio a escala nacional, con el fin de determinar la real prevalencia de norovirus en nuestro país. Ø Es prudente un análisis de secuenciación molecular de las diferentes cepas de norovirus GI y GII identificados mediante Real Time (Taq. Man®) RT-PCR, con el fin de homologar y comparar mediante un análisis filogenético las cepas circulantes en el Ecuador con las especies reportadas en la región y el mundo. 28 07/06/2021

Recomendaciones Ø Además, es necesario incluir en el presente, un análisis de norovirus en animales, así a través de una comparación de los patrones de similitud entre cepas de origen humano y cepas de origen animal, poder ayudar a esclarecer la posibilidad de un reservorio de calicivirus humanos en animales e incluso una potencial transmisión zoonótica. Ø Es necesario evaluar la calidad del agua que es suministrada y consumida por la población del cantón Quinindé, a través de estudios que permitan identificar la presencia de patógenos entéricos, incluyendo virus. 29 07/06/2021

GRACIAS 30 07/06/2021